《通过基因修饰的抗原特异性b淋巴细胞的体内扩增提高外源治疗基因的表达水平》由会员分享，可在线阅读，更多相关《通过基因修饰的抗原特异性b淋巴细胞的体内扩增提高外源治疗基因的表达水平（84页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、论文题目 通过基因修饰的抗原特异性B 淋巴细胞的体内扩增 提高外源治疗基因的表达水平 研究生姓名： 导师姓名： 导师组成员： 学科专业： 研究方向： 入学时间： 所在院所： 陈锋 梁植权教授 刘德培教授 吕湘博士 生物化学与分子生物学 基因治疗 20 0 5 年9 月 基础医学研究所 2 0 0 9 年1 月 舢删 Y 17 7 6 0 2 7 英文摘要 前言 1 2 3 4 5 安全和有效是当今基因治疗中共同关注的两大主题 病毒载体系统具有较高的基因转移效率但有严重的安全性问题 非病毒载体安全性好但效率较低 靶细胞是影响基因治疗效率的重要因素 本研究拟通过扩增基因修饰的B 淋巴细胞提高基因治
2、疗的效率 材料与方法 一、材料 1 菌株 2 细胞系 3限制性内切酶及其它酶类 4 载体 5 特异性抗体序列及抗原 6 实验动物 7 主要试剂及试剂盒 8 主要仪器 二、实验方法一 1 质粒载体的构建方法 2 1 1 酶切反应 1 2 D N A 片段回收 1 3 连接反应 1 4 感受态大肠杆菌细胞制备 1 5 转化 1 6 质粒D N A 的小量制备 1 7 质粒D N A 的大量制备 1 8R T P C R 1 9P C R 扩增D N A 片段 实验用载体的构建 2 1 逆转录病毒载体p M E G F P 的构建 2 2 逆转录病毒载体p M E L H c P l 的构建( 表达
3、E G F P 以及汉滩型汉坦病毒核心 蛋白特异性m I g G l ) 1 2 4 4 4 5 6 9 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 4 4 4 4 5 5 5 6 6 7 7 8 8 9 ltlI1-l_1_Il_l，l，ll，Il，l tI-_tl 3 3 细胞传代 3 4 复苏及冻存 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 结果 细胞转染及病毒载体包装 免疫荧光 与包装细胞系P T 6 7 共培养法感染原代小鼠脾B 淋巴细胞 荧光显微镜下观察感染后的表达绿色荧光蛋白的小鼠脾细胞 载体p 娅L H c P l 感染的小鼠原代脾B 淋巴细胞的体外扩增实验 细胞移植与受体鼠抗原免疫
4、 F A C s 定量分析表达绿色荧光蛋白细胞的比例 B A L B c 小鼠取血检测h E P O 的表达水平 1 载体构建 1 1 逆转录病毒载体p M E G F P 的构建 1 2 逆转录病毒载体p M E L H C P l 的构建- 1 3 逆转录病毒载体p M E 5 C 3 L H l 的构建 1 4 逆转录病毒载体p M h E 5 C 3 l 的构建 2 p 艇L H c P l 载体表达的汉滩犁汉坦病毒核心蛋白特异性m I g G l 能够与抗原汉 滩型汉坦病毒核心蛋白特异性结合 3 p M E L H C P l 载体基因修饰的B 淋巴细胞能够被抗原汉滩型汉坦病毒核心蛋
5、白 在体外特异性扩增 4 p M E L H C P l 载体基因修饰的脾B 淋巴细胞在S c I D 受体鼠体内能够被抗原汉滩 型汉坦病毒核心蛋白特异性扩增 5 外源治疗基因h E P O 表达水平在B A L B c 小鼠体内抗原特异性刺激后增高5 0 讨论 1 通过体内抗原特异性扩增基因修饰的B 淋巴细胞可以提高外源治疗基因的 表达水平 5 2 2 B C R 和其特异性抗原之间的亲和力有可能会影响基因修饰的B 淋巴细胞在 体内扩增的效率和寿命 3 与m I g M 和m I g D 型B C R 相比m I g G l 型B C R 可能更有效地增加外源治疗基因的表 达5 7 2 5
6、2 5 3 7 2 3 3 4 6 6 6 7 8 8 8 9 9 9 l l 1 l 2 3 4 5 8 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 致谢 个人简历 博士学位论文原创性、真实性声明 博士学位论文及论文相关实验材料使用授权书 3 鼹 矾 以 的 “ “ 侈 舳 北京协和医学院博士学位论文 中文摘要 基因治疗是指应用基因工程和细胞生物学技术，将一些具有治疗价值的外源基因 导入体内，通过修复或补充失去正常功能的某些基因来达到治疗疾病的目的。尽管有 关基因治疗的基础研究已经历时多年并广泛展开，少数基因治疗药物还获准在临床使 用，但是
7、因为安全性和有效性的问题，当前基因治疗研究的进展缓慢。因此安全和有 效是当今基因治疗中共同关注的两大主题。必须在保证安全性的基础上尽可能的提高 基因治疗的效率。影响基因治疗安全和效率的两个主要因素是基因转移系统和靶细 胞。目前应用于基因治疗的基因转移系统主要有病毒载体系统和非病毒载体系统。病 毒载体具有高效的优点，因此基因治疗研究广为采用。但是由于安全性问题，目前其 应用已受到了很大限制。非病毒载体尽管安全性较高，但其效率较低，离实际应用的 要求相差甚远。目前研究提高非病毒载体的效率来提高基因治疗的效率进展缓慢。提 高基因治疗效率的另一个可能途径是扩增用于基因治疗的靶细胞，使表达外源治疗基 因
8、的细胞数量增加，从而使外源治疗基因表达水平提高，最终提高基因治疗的效率。 造血干细胞和记忆性的淋巴细胞都是长寿命的细胞，有利于外源治疗基因转入后在体 内的长期表达，因而是目前基因治疗中较为常用的靶细胞。但是，造血干细胞和淋巴 细胞的体外长期培养和扩增非常困难，使这些靶细胞的应用受到了很大的限制。本研 究利用B 淋巴细胞受特异性抗原刺激后可在体内发生克隆增生并分化为记忆性B 淋巴 细胞的特性进行了实验设计，使B 淋巴细胞经过基因修饰，可以同时表达抗原特异性 受体和外源治疗基因，初步实现在细胞水平和实验小鼠体内外源基因修饰的B 淋巴细 胞的特异扩增，从而使外源治疗基因表达相对增加。本实验方法在进一
9、步优化的基础 上结合使用安全性基因治疗载体，可望有效地提高基因治疗的效率。 S a f e 够觚de 佑c i e n c ym a k cu pt h et 、o c r i t i c a lc o n c e m so fg e n em e r a p y ，o fw h i c h 鼢f e t y i sn od o u b t a b l e ，t l l ef i r s tc o n s i d e r a t i o n Ap r a c t i c a lg e n e 廿l e r a p ya l s on e e d s c o n s i d e r a b l
10、ee X p r e s s i o no fe X o g e n o u st l l e r a p e u t i cg e n e M a n yf a c t o r sa m c tt h eS a f e t ) ra n d e 衢c i e n c yo fg e n et h e r a p y ，s u c h 嬲m e 豫p e u t i cg e n e s ，伽唱e tc e l l s ，g e n ed e I i V e Us y S t e m s 舔 w e n 部t h ec o n 仃o l l a b l ee x p r e s s i o n
11、o f 饿m s g e n e s ，锄o n gw h i c ht h eg e n ed e l i V e qS y s t e I n s 锄dt a r g e tc e l l sa r ei nt h ec e n t r a lo f t h ec o n t e 斌 C u n e n t l yu s e dg e n ed e l i v e 拶s y s t e m sc 锄b ed i V i d e di n t o 俩og r o u p s ：V i r a l 锄d n o n - v i r a lv e c t o rs y s t e m s V h
12、 lv e c t o r sh o l dt l l ea d V 锄缸猖eo 仆i 曲l ye 伍c i e n tn 猢s 佬c t i o n ， b u tc o m eu pw i t hs e v e r es a f e 够p r o b l e m s N o n V i m lV e c t o r sa r eg e n e r a l l y 鼢佬rt h a nV h l a p p r o a c h e s ，b u tt h e i re 伍c i e n c yi sm u c hl o w e r I n c r e a s i n gt h ee m c
13、i e n c yo fn o n - V i m l V e c t o r sr e m a i nac h a l l e n g e A na l t e m a t i v ew a yt oi n c r e a s et l l ee m c i e n c yo fg e n et l l e r a p yw i t h o u ta n yc o S to fs a f e t ) ， i st oe x p a n d et a r g e tc e l l s B ys p e c i f i c 锄p l i f i c a t i o no ft 1 1 et a
14、玛e tc e l l st h a th a Sb e e n s u c c e s s f h l l ym o d i f i e dt 0e x p r e s s ce X o g e n o u st h e r a p e u t i cg e n e ，w em a ye V e n t I l a I l ya c h i e V e af o l d i n c r e a s eo f t h e r a p ye m c i e n c y I nc u r r e n tg e n em e r a p yr c s e a r c h ，t h em o s t
15、丘e q u e n t l y u s e dt a r g e tc e ni sh e m a t o p o i e t i cs t c mc e l l s A l t h o u g hh e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l si ss e l G r e n e w a b l e 卸dc 锄d e v e I o pi n t om 锄yc e I lt ) ，p e s ，b u tt h e yc 锄n o ts u s t a i n e da n dk e e p l e i r m u l t i p o t i a l 锄d
16、0 t h e rc h a r a c t e r si I l i I lv i 仃oc u l t u r ec o n d i t i o n s A sc o m et oBl y m p h o c ”e s ， t h e r ea r em a n yBl y m p h o c ”e si nt h ep 嘶p h e m lb 1 0 0 d 锄de a s yt os e p a m t e ，t h a ti s ，l e ya r c m u c hm o r ea n d s i e rt og e tt h a nh e m a t o p o i e t i cS t e mc e l l s A n du n d e rt h es i t u m u l a t i o no f 锄t i g e n ，Bl y
