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1、用BRET方法研究活细胞中GPCR蛋白相互作用的基本注意事项K. M. Kroeger1, K. A. Eidne1, Bernd Hutter2简介：BRET已经成功的应用于研究哺乳动物细胞中GPCR同源和异源二聚体以及涉及到受 体脱敏作用和交易的受体/-arrestin相互作用（综述，1）。BRET的显著优势是可以在活细胞中，正确的的位置实时的监测蛋白质和蛋白质之间的 相互作用。由于GPCR高度的疏水性和细胞本地化，测量蛋白质之间相互作用的常规技术（如：免疫共沉淀和酵母2杂交筛选）具有重大的缺陷。BRET是一个 简单的，快速均一法，可以克服这些限制。对7TM受体是一个普遍的过程。这个方法可
2、以作为研究非依赖于他们信号通路的几乎所有7TM受体的筛选方法。 BRET原理BRET是一种自然发生的现象，举个例子：在水母和海蜇中发生的水母素和GFP之间 发生的非放射性能量转移。可以通过标记了生物发光供体如：海肾的荧光素酶（Rluc）或者荧光受体如：增强型绿色或者黄色荧光蛋白（EGFP或EYFP） 的融合蛋白来研究BRET的相互作用。 当相互作用的部分在细胞内共表达，在底物腔肠素存在的情况下，当蛋白质距离足够近（在100内）， 将发生能量从Rluc到EYFP的能量转移，发出发射光（2）。依靠于供体和受体分子的严格的距离使BRET成为研究涉及到所有GPCR功能和通过激动剂 和拮抗剂的调节的受体
3、蛋白相互作用的理想工具。相似的，涉及到荧光供体和受体分子之间的能量转移的FRET技术，也代表了一种检测GPCR蛋白相互作用， 并且已经和成像技术结合在空间和时间上检测GPCR的相互作用的工具。不像FRET,它衍生出来的BRET不需要激发光，从而避免了自发荧光，漂白和细胞 的损坏的相关问题。因此，低背景荧光的BRET技术在检测低水平或者较弱的蛋白质相互作用时候非常灵敏（3）。FRET代表了一种检测GPCR蛋白相互作 用的，并且已经和成像技术结合在空间和时间上检测GPCR的相互作用的工具。通过单细胞BRET成像来确定蛋白质之间相互作用的细胞定位来显示在研究蛋白 质相互作用的中的重大进步。 BRET
4、应用为了应用BRET技术来研究受体的相互作用，细胞 中融合蛋白的共表达，如果这两个融合分子之间的距离足够近，那么光将从Rluc转移到EYFP.这个激发光，引起发射一个波长为530nm的发射光。 BRET被定量为在相同情况下，530nm和480nm的发光比率。最初BRET是在大肠杆菌中研究光敏生物钟蛋白的相互作用（2），其他几个组现在使用 BRET技术来研究哺乳动物细胞中GPCR蛋白的相互作用，包括受体同源二倍体（4-9）和异源二倍体（10-13）。GPCR和细胞内蛋白的相互作用要 求也要使用BRET技术检测受体功能，如：涉及到受体脱敏作用和内在化的受体/-arrestin的相互作用。因此，理论
5、上，BRET也是研究针对 GPCR功能的配体结合受体信号到脱敏作用，交易的受体相互作用的复杂实验的一种强大的工具。 Mithras LB940Mithras LB940是一款多功能酶标仪。独立光路系统（DOPS-Dedicated Optical Path System）保证了检测技术要求的最优化表现。他们的功能有发光，BRET，荧光（顶读和底读），光吸收，荧光偏振和AlphaScreen.另外， 提供选配件如：试剂进样器，温度控制和冷PMT检测模块。 图2：独立光路系统和Mithras LB940 方法：使用BRET方法研究一个潜在的蛋白质和蛋白质之间的相互作用涉及到几个步骤 （1）产生两种
6、感兴趣基因的蛋白质，他们的一个N和C末端分别和Rluc和EYFP融合。（2）在哺乳动物中共表达两种BRET融合蛋白。（3）检测 BRET信号。这种方法可以应用于研究哺乳动物细胞中任何蛋白质和蛋白质之间的相互作用。并且对于涉及到GPCRs的相互作用研究页没有限制。 BRET融合结构的生产构成编码BRET融合蛋白包括以下内容：1. 表达Rluc-EYFP融合蛋白的BRET融合结构的阳性对照（见注2）。2. BRET结构的阴性对照：如：单独表达Rluc和EYFP的pRluc, pEYFP，GPCRs对照（非感兴趣的GPCR）和其他融合了Rluc或者EYFP的蛋白，（见注3）。在我们的研究中，我们利用
7、促性腺激素释放激素（GnRH）促甲状腺激素释放激素（TRH）和2肾上腺素受体，他们都是C末端和Rluc和EYFP结合（见注3）。3. 首个感兴趣的蛋白的BRET供体结构，（C末端（GPCR/Rluc）或者N末端（Rluc/GPCR）标记为Rluc的GPCR的表达）（见注4-6）。4. 第二个感兴趣的蛋白的BRET受体结构（C末端（GPCR/EYFP）或者N末端（EYFP/GPCR）标记为EYFP的GPCR的表达）（见注4-6）。 BRET融合结构的转染和共表达1. 根据操作说明使用转染试剂来转染哺乳动物细胞（如：COS-1细胞，在转染以前，放置一天使6孔板的每个孔的密度达到2*105个细胞）（
8、见注7）。2. 单独转染带有GPCR/Rluc融合cDNA细胞或者共转染带有 GPCR/Rluc和GPCR/EYFP融合的cDNA（见注8）。Rluc 和 Rluc-EYFP BRET对照 cDNA也一同被转染，作为实验的阳性对照。阴性对照转染也同时进行，包括：其他GPCRs融合到EYFP或者Rluc上显示非特异性的BRET信号。（见注3 & 8）。 BRET实验1. 转然后48小时，使用磷酸盐缓冲液（PBS）/0.05%胰蛋白酶分离细胞。用PBS洗涤两次，悬浮在500l的PBS。使用EYFP表达的流式细胞仪或者LB940多功能酶标仪的荧光模块分析每次转染的大约100000个细胞。（见注6）.
9、对于BRET，96孔板的每个孔中添加40l细胞悬浮液（大约20000个细胞）2. 注入10ul腔肠素（新稀释到25M）到每个孔中，获得最终浓度为5uM,并立即使用带有预设为所需温度（37度）加热模块LB940进行读数（见注9，10）。3. 测试在相互作用中的激动剂和拮抗剂（或者其他试剂，化学/处理）的影响，增强BRET信号，试剂可以在添加腔肠素前预孵育。或者添加腔肠素，控制“未处理”读数数据，最后通过注射器添加最多三个试剂，随着时间的推移评估BRET比率的影响。4. 采用综合读数10秒，收集通过两个不同波长范围的的滤光片的光。图1：测量BRET信号的读数选项。第一个标记的发光为Rluc滤光片选
10、项，第二个标记的发光为EYFP选项。 用两次测量的结果根据下面的公式计算BRET比率。BRET比率=530nm发射光/480nm发射光5. 然后，数据作为一个标准化的BRET比率。定义为，在同一个实验中，Rluc和EYFP结构共表达的BRET比率比上Rluc结构单独表达的BRET比率。 说明：1. 在BRET实验中使用的腔肠素的形式是非常重要的。几种不同形式的腔肠素的存在，每种可以导致稍微不同波 长光的峰值发射光。为了能够发生能量转移，供体（Rluc）的发射光谱需要和能量受体（EYFP）的激发/吸收光谱显著重叠。另外，供体和受体的发射光谱 必须能够足够的区分，以允许有最小重叠分子的发射光能够分
11、开测量。考虑到这些因素，使用Rluc和EYFP分别作为供体和受体分子，腔肠素的H形式被使用 在BRET实验中。腔肠素溶解在甲醇中作为储藏液（500M）在20oC下避光保存。仅仅在使用前，腔肠素被BRET试验缓冲液稀释到最终浓度为2M, 用铝箔包装，以避光。2. 为了确认BRET信号可以在实验条件下获得，应该使用BRET阳性对照。通过氨基酸连接器分开直接融合的 Rluc和 EYFP蛋白是一个很好的BRET阳性对照。通过克隆没有它的终止密码子上游并且添加EYFP编码序列的萤光素酶编码区来准备。然后添加腔肠素到细胞中表 达Rluc-EYFP融合。Rluc的发射光直接转移到EYFP,引起了很高的BRE
12、T信号，比较从Rluc和 EYFP或单独的Rluc来获得BRET比率3. 当检测受体和受体，或者受体-蛋白质相互作用的时候，在BRET实验中，使用阴性对照是重要的。包括分别 标记了Rluc或者EYFP和未标记EYFP或Rluc受体的表达，来确定BRET信号在相同的细胞中是否仅仅是由于Rluc和 EYFP的过表达。为了评估受体-蛋白质BRET信号的特异性，添加使用其他标记的受体的阴性对照，在这些对照中，标记受体和感兴趣的受体在相似的水平上 表达。另外，非标记蛋白可以和供体和受体BRET融合共转染，来破坏他们之间的相互作痛从而降低BRET信号。这个方法适合来评估依靠标记了Rluc或者 EYFP的T
13、RHRs的共表达来获得的BRET信号的特异性。4. 为了确定在TRHRs中是否发生了相互作用（homo- oligomerization），用Rluc或者EYFP来标记TRHRs的C末端产生TRHR/Rluc 或者TRHR/EYFP （5）。5. 没有BRET信号并不意味着相互作用的缺乏，也可能意味着供体和受体标记不在 一个有利于能量转移的方向。Rluc或者EYFP融合了N或者C末端标记的部分感兴趣的蛋白突出的显示了BRET的重要性。使用这种方法，两种分别带有优 化方向和距离融合分子的供体和受体的伙伴蛋白的相互作用的组合可以给出更灵敏的BRET信号，可以被确定。在感兴趣的融合EYFP或Rluc
14、的蛋白质之间 插入氨基酸连接器序列可能是有用的。当执行BRET来检测受体-蛋白之间的相互作用，受体一般标记在C末端而不是N末端来增加正确折叠和受体膜定位，减少 与配体结合干扰的机会。6. 与非标记蛋白相比，可以评价BRET融合蛋白的功能，当有可能，在使用 BRET方法之前。另外，添加Rluc或者EYFP到受体或者感兴趣的蛋白可能干扰表达，折叠，定位 或者蛋白质功能，在评估潜在受体相互作用的相关性前，确定标记蛋白的功能是否受损是非常重要的。为了评估BRET受体融合结构的功能，需要在 receptor/Rluc和receptor/EYFP融合子与非标记受体进行比较来进行受体结合和信号实验（5）。相
15、互作用的蛋白（- arrestin）受体的特性将决定采用何种实验来评估特定感兴趣的蛋白的功能是否保留。在-arrestin作为感兴趣的蛋白的情况下。- arrestin/EYFP或Rluc的融合功能进行评估用1）受体内部化试验来测量促进GPCR内部化的能力。2）共聚焦显微镜来监测- arrestin/EYFP的配体依赖性易位（5）。在转然后48小时，通过使用Mithras LB940 多功能酶标的发光模块测量发光来评估Rluc标记蛋白的表达水平，通过使用Mithras LB940 多功能酶标的荧光模块或者带有荧光活性的流式细胞仪测量荧光来确定EYFP标记蛋白的表达水平。图2A：测量Rluc表达
16、的发光模块的设置。双击“Read options”对话框下“Measurement”标签左侧的“lumin label”图2A：测量Rluc表图2B：EYFP表达的荧光模块的设置，双击“Read options”对话框下“Measurement”标签左侧的“fluor label” 7. 在BRET试验方案中已经使用了COS-1细胞。然而，可以在任何细胞类型中进行的BRET也可以进行转 染。各种转染试剂和技术可以应用于转染带有cDNA结构的细胞。在我们的手中，使用Polyfect 转染试剂（QIAGEN）可以获得一直的结果。然而，使用的转染试剂要随着选择的细胞类型而变化。8. 在进行BRET试验时，Rluc比EYFP融合蛋白表达的水平重要。不同数量的Rluc 和 EYFP融合cDNA被传染和实验来决定获得最优化BRET信
