发酵液的预处理讲解

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1、发酵液（或培养液） 的预处理 预处理和固液分离的目的： 1、分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒(细胞碎片、核酸和 蛋白质的沉淀物)。 2、除去部分可溶性杂质。 3、改变滤液的物理性质（降低粘度等），以利于后继 操作。 总策略： 1、胞外产物：应尽可能转移到液相中，常用 调pH至酸性或碱性的方法来达到。 2、胞内产物：首先收集细胞、破壁，生化物 质释放到液相，再分离细胞碎片。 3、通常，以含生化物质的液相为出发点，进 行后继操作。 一、发酵液的预处理 1、改变液体物理性质，促进固液分离。 细菌及某些放线菌菌体细小，发酵液粘度大，不能直 接过滤，由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它有机粘性物 质的存在会造成

2、滤液浑浊，滤速极慢，因此，在预处理中 应采用絮凝或凝聚的方法，设法增大悬浮液中固体粒子的 大小，提高其沉降速度，或采用稀释、加热等方法降低粘 度，以利于过滤。 必要性： 2、发酵液杂质很多，其中影响最大的是高价无机 离子和杂蛋白，预处理时，应尽量除去。 高价无机离子危害： 在采用离子交换法提炼时，影响树脂的交换 容量。 杂蛋白质的危害： a) 离子交换法和大网格树脂吸附法提炼时，会降 低吸附能力， b) 萃取时，易产生乳化。 c) 过滤或膜过滤时，使滤速下降，膜受到污染。 （一）、凝聚和絮凝 凝聚：在中性盐电解质作用下，破坏胶体粒子 的分散状态使之聚集的过程。 絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下

3、，在悬浮 粒子之间产生架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团 的过程。 基本概念： 凝聚和絮凝技术能有效地改变细胞、菌 体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使聚集 起来，增大体积，以便于过滤。 常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的 预处理。 一般来说，反离子的价数越高，该值就越小，即凝聚能力越强。 阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序： 常用的凝聚剂电解质有： Al(OH)3 、Fe3O4、Ca(OH)2、石灰等 有机高分子聚合物絮凝剂具有长链线状结构，是水溶性 聚合物，分子量高达数万至一千万以上，在长的链节上含有 相当多的活性功能团，可以带有多价电荷，也可以不带电性 。 它们通过静电引力、范德华分子引力

4、或氢键的作用，强 烈地吸附在胶粒的表面，一个高分子聚合物的许多链节分别 吸附在不同颗粒的表面上，产生架桥联接，生成粗大的絮团 ，这就是絮凝作用。 2、絮凝作用 A. 聚丙烯酰胺类衍生物 B. 聚苯乙烯类衍生物 C. 无机高分子聚合物絮凝剂，如聚合铝盐和聚合铁盐等 。 D. 天然有机高分子絮凝剂：多聚糖类胶粘物，海藻酸钠 ，明胶、骨胶、壳多糖和脱乙酰壳多糖等。 絮凝剂 根据活性基团在水中解离情况不同，可分为非离子型、阴离 子型(含有羧基)和阳离子型(含有胺基)三类。 优点：用量少，般以ppm计，絮凝体粗大，分离效果好 ，絮凝速度快、种类多，适用范围广。 缺点：存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯

5、酰胺 。 近年来还发展了聚丙烯酸类阴离子聚凝剂，它们无毒 ，可用于食品和医药工业中。 聚丙烯酰胺类絮凝剂： 非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，主要通过分子间引力和氢 键产生吸附架桥，常与无机电解质凝聚剂搭配使用。 首先加入无机电解质，使悬浮粒子脱稳而凝聚，然后，再 加入絮凝剂。凝聚作用为絮凝剂的架桥创造了良好的条件，从 而，提高了絮凝效果。 这种包括凝聚和絮凝机理的过程，常称为混凝。 混凝： 1) 絮凝剂浓度（用量） 2) 絮凝剂分子量 3) 絮凝剂类型 4) 溶液的pH 5) 搅拌速度和时间 6) 助凝剂 影响絮凝效果的因素： （二）、杂蛋白的去除方法 蛋白质等电点多在pH 4.0-5.5，此

6、时溶解度最小。但单 靠等电点法不能将大部分蛋白质除去。 1、等电点法： 2、变性法： 变性蛋白质溶解度较小。最常用方法是加热。 只适于热稳定的物质。 大幅度改变pH，加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂 等。 在酸性溶液中，蛋白质能与一些阴离子如三氯乙 酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、蹂酸盐、 过氯酸盐等形成沉淀。 在碱性溶液，蛋白质能与一些阳离子，如 Ag+，Cu2+，Zn2+，Fe3+和Pb2+等形成沉 淀。 应用举例： 1、链霉素发酵液，调至酸性(pH 3.0)，加热至70 ，维持l2h，能去除蛋白质，使过滤速度增大10一 100倍，滤液粘度可降低1/6。 2、柠檬酸发酵液，加热至80以

7、上，使蛋白质变性 凝固，降低发酵液粘度，大大提高过滤速度。 举例： 1、四环类抗生素生产中，采用黄血盐和硫酸锌的协同 作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质，取得很好 的效果。 2、枯草杆菌发酵液，常加入氯化钙和磷酸氢二钠，生 成磷酸钙盐沉淀，把蛋白质、菌体及不溶性粒子吸附并包裹 在其中而除去，从而加快了过滤速度。 利用吸附作用除去蛋白质： （三）高价无机离子的去除 Ga2+：加入草酸和草酸盐，生成草酸钙；加入磷 酸盐，生成磷酸钙 Mg2+：加入草酸（沉淀不完全）；加入磷酸盐， 生成磷酸镁；三聚磷酸钠（Na5P3O10），生成可 溶性络合物 Fe3+：加入黄血盐，生成普鲁士兰沉淀 二、 发

8、酵液的过滤 发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余的 固体培养基成分，过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒 与液体进行分离的过程。 定义： 在一定的压力差下，利用多孔性介质截留固液悬浮液中 的固体粒子，进行固液分离的方法称为过滤。 1.过滤介质 使滤液通过，截留固体颗粒并支撑滤饼的材料。 要求其具有多孔性、耐腐蚀性及足够的机械强度。 工业常用的过滤介质：织物介质、多孔性固体、 粒状介质。 无定形颗粒：无烟煤、砂、颗粒活性炭、铁矿砂等 成形颗粒：烧结金属、烧结塑料以及用合成树脂粘 结的硅砂、塑料颗粒等，做成圆筒形或板状。 非金属织补棉：化学纤维、玻璃纤维织品、长纤维 滤布、短纤维滤布。 金属

9、织布：不锈钢丝或铁丝等的织布。 无纺品：纸、毡、石棉板、合成纤维无纺布等。 2.滤饼的压缩性及助滤剂 （1）滤饼的压缩性：受力不变形的颗粒形成的滤饼 称不可压缩性滤饼，反之则称为可压缩性滤饼。发酵 液悬浮颗粒属于可压缩性颗粒 。 （2）助滤剂：减小过滤阻力、提高滤饼的刚性和孔 隙率的惰性材料。 （3）过滤推动力：过滤介质两侧的压力差。 （4）过滤速率：单位时间内通过的滤液体积。 3.过滤方式分类： 常压过滤、加压过滤、减压过滤、离心过滤。 4、过滤基本方程式 衡量各种物质过滤特性的主要指标是滤饼的重量比阻r B （），表示单位滤饼厚度的阻力系数，与滤饼的结构特性 有关。 对于不可压缩性滤饼，比

10、阻值为常数，但对于可压缩性 滤饼， r B是操作压力差的函数、一般可用下式表示： 由此可见滤饼的比阻值是随操作压力差的提高而增大的 。因此开始过滤时应注意不能很快提高压差，通常靠液柱的 自然压差进料，并应缓慢地逐步地升高压力，一般在相当长 的时间内，压力差不要超过0.05MPa，最后的压差(不包括榨 滤)也不超过0.3一0.4MPa。 滤饼阻力与滤饼干重之间的关系 Rc表示滤饼的阻力 A为过滤面积m2 恒压下，可压缩性滤饼的比阻值应为常数。如过滤 介质的阻力相对较小可以忽略不计，则恒压下的过滤方 程式如下： （二）、影响过滤速度的因素 菌种 发酵条件(培养基的组成，未用完培养基的数量，消沫油，

11、 发酵周期)。 过滤条件：压力等 菌种对过滤速度影响很大。 真菌：菌丝粗大，容易过滤，不需特殊处理。滤渣呈紧密 饼状物，易从滤布上刮下，可采用鼓式真空过滤机过滤。 放线菌：菌丝细而分枝，交织成网络状，还含有很多多糖 类物质，粘性强，重量比阻r B值高，过滤困难，一般需经预 处理，以凝固蛋白质等胶体。 细菌：菌体更细小，过滤十分困难，如不用絮凝等方法预 处理发酵液，往往难以采用常规过滤的设备来完成过滤操作。 1、菌种 培养基的组成对过滤速度影响也很大。 黄豆粉、花生饼作氮源、淀粉作碳源会使过滤困难。 举例：a 、在链霉素发酵液的培养基中，加以黄豆粉代替 玉米浆，则比阻值增大0.61.0倍。 b、

12、 在青霉素发酵的培养基中，加入酵母蛋白，rB 值也提高很多。 此外，发酵后期加消沫油或剩余大量末用完的培养基都 会使过滤困难。 2、培养基 正确选择发酵终了时间对过滤影响很大。 在菌丝自溶前必须放罐，因为细胞自溶后的分解产物很 难过滤。 有时延长发酵周期虽能使发酵单位有所提高，但严重影 响发酵液质量，使色素和胶状杂质增多、过滤困难，最终造 成成品质量降低。 3、发酵时间 （三）、改善过滤性能的方法 对于难过滤的发酵液，必须设法改善过滤性能、降低滤 饼的比阻值，以提高过滤速度。 改善过滤性能的方法： 1、预处理发酵液。等电点，蛋白质变性、吸附以及凝聚 和絮凝等方法。 2、加入助滤剂，直接在发酵液

13、中形成填充一凝固剂。 3、酶解作用 助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，能使滤饼疏松 ，滤速增大。 常用的助滤剂：硅酸盐粉末(硅藻土）、纸浆、珠光 石 (即珍珠岩，成分为二氧化硅）。 要求：助滤剂必须不吸附或很少吸附生化物质。 1、加入助滤剂 加入方式： 1、在滤布上预先铺一层助滤剂(12mm)，采用此种 方法，会使滤速降低，但滤液透明度很快增加。 2、直接加入发酵液中。助滤剂用量若等于悬浮液中 固体含量时，滤速最快。 反应剂相互作用，或和溶解性盐发生反应，生成沉淀 。能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构。 沉淀本身即可作为助滤剂，并且还能使胶状物和悬浮 物凝固。 正确选择反应剂和反应条件，能使过

14、滤速度提高310 倍。 2、加入反应剂 举例： A. 新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠，生成的磷酸钙 可作为填充凝固剂。一方面作为助滤剂，另一方面 还可使某些蛋白质凝固。 B. 环丝氨酸发酵液用氧化钙和磷酸处理，生成的磷酸钙沉 淀，熊使悬浮物凝固。多余的磷酸根离子，还能除去钙 、镁离子。 v 如果发酵液中有不溶解的多糖存在，则最好用酶将它转化 为单糖，以提高过滤速度。 v 例如：万古霉素用淀粉作培养基，加入淀粉酶后，能使过 滤速度加快。 3、采用酶制剂分解黏性物质 v 发酵液染菌后，会含很多细菌菌体，杂质也增多，造成过 滤困难。 v 杂菌的种类不同，对过滤的影响也不同。一般染霉菌尚可 ，染产

15、气杆菌则很难过滤。 v 处理方法：升高温度、增加纯化剂用量、加助滤剂等。 v 举例：四环素染菌发酵液可以采用加温至40一50，增 加黄血盐、硫酸锌用量，以正常批号的滤渣作为助滤剂等办 法。 4、染菌发酵液的处理方法 （四）、固液分离设备的选择 不同性状的发酵液应选择不同的固液分离设备。 常用分离设备：板框压滤机，鼓式真空过滤机和离心沉 降分离机等。 优点：过滤面积大，过滤推动力(压力差)能较大幅度地进行 调整，并能耐受较高的压力差，故对不同过滤特性的发酵液适 应性强，同时还具有结构简单，价格低，动力消托少等优点。 缺点：不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差 ，非生产的辅助时间长(包括

16、解框、卸饼、洗滤饼，洗滤布， 重新压紧板框等)，阻碍了过滤效率的提高。 自动板框过滤机： 是一种较新型的压滤设备，板框的拆装，滤渣的脱落 卸出和滤布的清洗等操作都能自动进行，大大缩短了非生 产的辅助时间和减轻了劳动强度。 对于菌体较细小、粘度较大的发酵液，可加入助滤剂或 采用絮凝等方法预处理后进行压滤。 对于难过滤的枯草杆菌发酵液，可设计一种特别薄的滤 框以减小滤饼的阻力。 另外，也可采用带有橡皮隔膜的压滤机，过滤结束时， 在滤板和橡皮膜之间通入压缩空气来压札滤饼，将液体挤压 出来。 常用技术措施 鼓式真空过滤机能连 续操作，并能实现自动化 控制，但是压差较小，主 要适用于霉菌发酵液的过 滤。而对菌体较细或粘稠 的发酵液不太适用。 一种较好的解决办法 是，过滤前在转鼓面上预 铺一层助滤剂，操作时， 用一把缓慢向鼓面移动的 刮刀将滤饼连同极薄的一 层助滤剂一起刮去，这样 使过滤面积不断更新，以 维持正常的过滤速度。 离心分离具有分离速度快，效率高，操作时卫生条件好 等优点，适合于大规模的分离过程。但是，离心分离的设备 投资费用高，