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1、第六章 发酵工程基本操作 主讲人：刘萍 第一节 严格消毒灭菌 控制有害微生物主要有以下几种措施 （一）灭菌（sterilization） 采用强烈的理化因素使任何物体内外 部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力 的措施，称为灭菌，例如各种高温灭菌措 施等。 灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前者指 菌体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀 死后，其细胞发生溶化、消失的现象 。 （二）消毒（disinfection） 从字义上来看，消毒就是消除毒害 ，这里的“毒害”就是指传染源或致病菌 的意思，英文中的“dis-infection”也是“消 除传染”的意思。 所以，消毒是一种采用较温和的理化因 素，仅杀死
2、物体表面或内部一部分对人 体有害的病原菌，而对被消毒的物体基 本无害的措施。 （三）防腐（antisepsis） 防腐就是利用某种理化因素完全抑 制霉腐微生物的生长繁殖，从而达 到防止食品等发生霉腐的措施。 （1）低温 （2）缺氧 （3）干燥 （4）高渗 （5）高酸度 （6）防腐剂 （四）化疗（chemotherapy） 化疗即化学治疗。它是利用具有高度选 择毒力（即对病原菌具有高度毒力而对 宿主无显著毒性）的化学物质来抑制宿 主体内病原微生物的生长繁殖，借以达 到治疗该传染病的一种措施。 用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂 。最重要的化学治疗剂如各种抗生素、 磺胺类药物和中草药中的有效成分等
3、。 除菌的方法 培养基的加热灭菌（包括常压或蒸汽高 压加热法） 空气的过滤除菌 紫外线或电离辐射 化学药物灭菌 （一）高温杀菌作用的种类 高温致死原理：由于它使微生物的蛋白质和核 酸等重要生物高分子发生变性、破坏，例如它 可使核酸发生脱氨、脱嘌呤或降解，以及破坏 细胞膜上的类脂质成分等。 湿热灭菌要比干热灭菌更有效，这一方面是由 于湿热易于传递热量，另一方面是由于湿热更 易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，从而 加速其变性。 1干热灭菌法， 将金属制品或清洁玻璃器皿放 入电热烘箱内，在150170下维持12小时 后，即可达到彻底灭菌的目的。 在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、 原生质干
4、燥，以及各种细胞成分发生氧化。 灼烧，是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能 用于接种环、接种针等少数对象的灭菌。 2湿热灭菌法 湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。 多数细菌和真菌的营养细胞在60左右 处理510min后即可杀死； 酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用 80以上的温度处理才能杀死； 而细菌的芽孢最耐热，一般要在120下 处理15min才能杀死。 （1）常压法 巴氏消毒法（pasteurization） 用于牛奶、啤酒 、果酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一 种消毒方法，其主要目的是杀死其中无芽孢的 病原菌（如牛奶中的结核杆菌或沙门氏菌）， 而又不影响它们的风味。 巴氏消毒法是一种低温消
5、毒法 低温维持法：在63下保持30分钟可进行牛奶 消毒； 高温瞬时法：用于牛奶消毒时只要在72下保 持15秒钟即可。 间歇灭菌法，又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法 。适用于不耐热培养基的灭菌。 方法是：将待灭菌的培养基在80100下蒸 煮1560分钟，以杀死其中所有微生物的营养 细胞，然后置室温或37下保温过夜，诱导残 留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过 夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下达 到彻底灭菌的效果。 （2）加压法 常规加压灭菌法 盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，彻底 驱尽后将锅密闭，再继续加热至121（压力 为1kgcm2或15磅英寸2），时间维持15 20分钟，也可采用
6、在较低的温度（115，即 0.7kgcm2或10磅英寸2）下维持35分钟的方 法。 此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机 构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的 灭菌。 连续加压灭菌法 在发酵行业里也称“连消法”。此法只在 大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用。 主要操作：将培养基在发酵罐外连续不 断地进行加热、维持和冷却，然后才进 入发酵罐。培养基一般在135140下 处理515秒钟。 连续加压灭菌法优点 因采用高温瞬时灭菌，故既可杀灭微生物，又 可最大限度减少营养成分的破坏，从而提高了 原料的利用率，比“实罐灭菌”（120，30分 钟）提高产量510； 由于总的灭菌时间较分批灭菌注明显减
7、少，所 以缩短了发酵罐的占用周期，从而提高了它的 利用率； 由于蒸汽负荷均匀，故提高了锅炉的利用率； 适宜于自动化操作； 降低了操作人员的劳动强度。 （二）影响加压蒸汽灭菌效果 的因素 （1）灭菌物体含菌量的影响。 天然原料尤其是麸皮等植物性原料配 成的培养基，一般含菌量较高，而用纯粹 化学试剂配制成的组合培养基，含菌量低 。 （2）灭菌锅内空气排除程度的影响 检验灭菌锅内空气排除度，可采用 多种方法。最好的办法是灭菌锅上同时 装有压力表和温度计，其次是将待测气 体通过橡胶管引入深层冷水中，如只听 到“扑扑”声而未见有气泡冒出，也可证 明锅内已是纯蒸汽了。 （3）灭菌对象pH的影响 （4）灭菌
8、对象的体积。要防止用常规的 压力和时间在加压灭菌锅内进行大容量培 养基的灭菌。 （5）加热与散热速度。这两段时间也对 灭菌效果和培养基成分发生影响。为了使 科学研究的结果有良好的重演性，在灭菌 操作中对这些技术细节都应加以注意。 （三）高温对培养基成分的有 害影响及其防止 消除高温有害影响的措施 （1）采用特殊加热灭菌法 （2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时 ，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再 合并； （3）对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐 先作分别灭菌，然后再混合，就不易形 成磷酸盐沉淀； （4）对含有在高温下易破坏成分的培养基 （如含糖组合培养基）可进行低压灭菌 （在112即0.57
9、kgcm2或8磅英寸2下 灭菌15分钟）或间歇灭菌； （5）在大规模发酵工业中，可采用连续加 压灭菌法进行培养基的灭菌 (二)灭菌设备 l、高压蒸汽灭菌 生产中使用高压蒸汽灭菌锅 的型号很多 手提式灭菌锅，容量小，多用于母种培养基灭菌 。 立式或卧式灭菌锅较大，多用于原种或少量栽培 种培养基的灭菌，一般能装几十瓶或几百瓶。 灭菌柜要和蒸汽锅炉配套，用于大量的原种和栽 培种培养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶(袋 )。但投资太大，适合大型菌种场使用。 2常压蒸汽灭菌锅 常压蒸汽灭菌锅是 用铁锅、砖、水泥砌成的，造价低，适 于一般生产单位和专业户使用。大小可 根据需要而定，但最大的锅每次装料也 最好
10、不超过500公斤。 3烘箱 烘箱主要是用于玻璃器皿的干 燥和灭菌，也可用于其它物品烘干。 第四节 培养基的灭菌 、湿热灭菌的基本原理： 湿热灭菌是直接用蒸汽灭菌。蒸汽冷 凝时释放大量潜热，并具有强有强大的 穿透力，在高温和水存在时，微生物细 胞中的蛋白质极易发生不可逆的凝固性 变性，致使微生物在短时间内死亡。 由于湿热灭菌有经济和快速等特点，因 此被广泛用于工业生产。 用蒸汽加热的方法对培养基灭菌的要求 是: 既要达到一定的灭菌程度， 又要尽量减少营养成分的破坏。 （一）理论灭菌时间 某些分子的分解和分子内部的重新排列 的反应属于单分子反应。 杂菌虽然是一个复杂的高分子体系，但 其受热被杀死，
11、主要原因是高温能使蛋 白质变性，这种反应属与单分子反应， 因此杂菌在一定温度下受热死亡也遵循 单分子反应方程。 =(2.303/k)log(No/Ns) - -灭菌时间（秒） k-反应速度常数，与菌的种类和加热温度有关（s） No-灭菌开始时，污染的培养基中杂菌个数（个ml） Ns-经过灭菌时间T后，残存活菌个数（个ml） （二）灭菌温度与菌反应速度 常数的关系 灭菌温度与菌死亡反应速度常数的关系： k=Ae-E/RT K菌死亡的速度常数（1秒），当反应物的浓度为单位浓度时， 则反应速度常数在数值上等于反应速度 A阿累尼乌斯常数（1秒） R气体常数（1.987*4.817焦开摩尔） T绝对温度
12、（开） 二、影响培养基灭菌的因素 1、pH值的影响 pH值对微生物的耐热性影响很 大，pH为6.08.0时微生物最 不易死亡， pH 6.0时氢离子 易渗入微生物的细胞内。 2、培养基成分 培养基的成分中，油脂、糖类、蛋白质 都是传热的不良介质，会增加微生物的 耐热性，使灭菌困难。 浓度较高的培养基相对需要较高温度和 较长时间灭菌。 高浓度的盐类，色素则削弱其耐热性， 故较易灭菌。 3、培养基中的颗粒物质 培养基中的颗粒物质大，灭菌困难，反 之，灭菌容易。一般说来，含有颗粒对 培养基灭菌影响不大，但在培养基混有 较大颗粒，特别是存在凝结成团的胶体 时，会影响灭菌效果，必须过滤除去。 三、灭菌的
13、实际操作 （一）空罐灭菌 空罐灭菌也称空消。无论是种子罐、发酵罐、 还是尿素（或液氨）罐、消泡罐，当培养基（ 或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌，为空 罐灭菌。 为了杀死所有微生物特别是耐热的的芽孢，空 罐灭菌要求温度较高，灭菌时间较长，只有这 样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。 （二）实罐灭菌 将培养基置于发酵罐中用蒸汽加热，达到预定 灭菌温度后，维持一定时间，再冷却到发酵温 度，然后接种发酵，这叫做实罐灭菌，又称分 批灭菌。 操作要点： 三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进 入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持 一定的时间。这就是所谓的“三路进气”。 培养基连消工艺流程图 （
14、2）过滤除菌法 是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使 大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留， 从而达到除菌目的。在体外培养时， 过滤除菌大多用于遇热容易变性而失 效的试剂或培养液。 目前，大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌 。关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。 滤膜过滤装置、烧结玻璃滤板过滤器、石 棉板过滤器（Seitz滤器）、素烧瓷过滤器 以及硅藻土过滤器等。过滤除菌的缺点是 无法去除其中的病毒和噬菌体。 （3）其他方法 在配制培养基时，为避免发生沉淀，一 般应按配方逐一加入各种成分。 另外，加入0.01EDTA或0.01NTA（ 氮川三乙酸）等螯合剂到培养基中，可 防止金属离子发生沉淀。 最后，还可以用
15、气体灭菌剂如氧化乙烯 等对个别成分进行灭菌处理。 三、化学杀菌剂或制菌剂 （一）表面消毒剂 常用消毒剂的种类很多，它们的杀菌强度 各不相同。但几乎都有一个共同规律，即当其 在极低浓度时，常常会对微生物的生命活动起 刺激作用，随着浓度逐渐增高，就相继出现制 菌和杀菌作用，因而形成一个连续的作用谱。 表面消毒剂是指对一切活细胞都有毒性，不能 用作活细胞内的化学治疗用的化学药剂。 为比较各种表面消毒剂的相对杀菌强度，常采 用在临床上最早使用的消毒剂石炭酸作为 比较的标准，并提出了石炭酸系数这一指标。 所谓石炭酸系数，指在一定时间内被试药剂能 杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效的石 炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间 为10分钟，而供试菌定为Salmonellatyphi（伤 寒沙门氏菌）。 消 毒 试 验 以人工染菌实物为消毒对象，模拟现场表面 污染大肠杆菌液。 消毒前采样：放置无菌规格板，取无菌棉拭 于含5ml稀释液试管中沾湿， 在规格板空心处旋 转自左至右涂抹整个区域 消毒后采样：在前采样地点旁用0.05过氧 乙酸溶液消毒物体表面，30分钟后将无菌棉 拭 于含5ml采样液试管中沾湿，作为消毒后样液。 将消毒前后样液充分振荡摇匀后稀释 培养待凝固后37培养2448小时，
