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1、任务五测定食品中的蛋白质及氨基酸 李京东 余奇飞 刘丽红 1食品分析与检验技术 v技能目标 1会测定食品中粗蛋白含量。 2会测定食品中氨基酸总量。 3会测定食品中不同氨基酸含量。 v知识目标 1明确常见的食品蛋白质含量，以及测定原理。 2明确食品氨基酸总量的含量，以及测定原理。 2食品分析与检验技术 项目一：测定食品中蛋白质 v一、案例 v二、选用的国家标准 GB 5009.5-2010食品中蛋白质的测定凯氏定氮法。 3食品分析与检验技术 v三、测定方法 1样品消化 v 准确称取固体样品0.22g ,半固体样品25g，液体样品 1025g，使试样中含氮3040mg （精确至0.001g），小心
2、 移入干燥洁净的100mL或500mL凯氏烧瓶中，然后依次加硫酸 铜0.2g、硫酸钾6g、浓硫酸20mL、玻璃珠数粒，轻轻摇匀后 ，安装消化装置。 v将凯氏烧瓶45斜放在电炉上，于瓶口放一漏斗，缓慢加热， 待内容物全部炭化，泡沫停止后，加大火力，保持液面微沸至 溶液呈蓝绿色透明时，继续加热0.51h，取下凯氏烧瓶冷却 后，缓慢加入20mL水，冷却至室温。 4食品分析与检验技术 v2蒸馏、吸收 （1）常量蒸馏： 装好蒸馏装置。接收瓶内加入10mL 4%硼酸溶液及45滴甲基红- 溴甲酚绿混合指示液，置于蒸馏装置的冷凝管下口，并使冷凝管下 口浸入硼酸溶液中。 放松夹子，沿漏斗向凯氏烧瓶中缓慢加入70
3、80mL40%氢氧化钠 溶液，摇动凯氏瓶，至瓶内溶液变为深蓝色，或产生黑色沉淀，再 从漏斗加入100mL蒸馏水，夹紧夹子。 加热蒸馏，蒸馏30min(始终保持液面沸腾)，至氨全部蒸出(约 250mL蒸馏液)。 降低接收瓶的位置，使冷凝管口离开液面，继续蒸馏13min，用 表面皿接几滴溜出液，以奈氏试剂检查，如无红棕色生成，表示蒸 馏完毕。 停止加热，用少量水冲洗冷凝管管口，洗液并入接收瓶内，取下接 收瓶，用0.1000mol/L的盐酸标准溶液滴定至终点；同时做空白实验 ，记录空白滴定消耗盐酸标准溶液体积。 5食品分析与检验技术 6食品分析与检验技术 v（2）微量蒸馏： 安装好定氮蒸馏装置。在水
4、蒸气发生瓶中装水至2/3容积处，加甲基 橙指示剂数滴及硫酸数毫升，保持水呈酸性（淡红色），加热煮沸 ，将样品消化液转移到100mL容量瓶中并定容、摇匀。 接收瓶内加入10mL 4%硼酸溶液和1滴混合指示剂，置于蒸馏装置的 冷凝管下口，浸入硼酸溶液中，取210mL稀释样液，移入反应室 ，并用少量蒸馏水冲洗，塞紧玻璃塞，然后向反应室加入 10mL400g/L氢氧化钠溶液，立即塞紧玻璃塞，加水密封。 蒸馏至硼酸吸收液中指示剂变为绿色开始计时，继续蒸馏10min后， 将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，冲洗冷凝管管口。 取下接收瓶，用0.1000mol/L的盐酸标准溶液滴定至终点，同时做空 白实验，记
5、录空白滴定消耗盐酸标准溶液体积。 7食品分析与检验技术 8食品分析与检验技术 v3结果计算 常量蒸馏按下式计算: 微量蒸馏按下式计算： v式中 vX食品中蛋白质质量分数，%； vV滴定试样时消耗盐酸标准滴定溶液的体积，mL； vV0空白试验时消耗盐酸标准滴定溶液的体积，mL； vc盐酸标准滴定溶液的浓度； v0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol； vm试样的质量，g； vF氮换算为蛋白质的系数。 9食品分析与检验技术 v4试剂 硫酸铜CuSO45H2O、硫酸钾、硫酸(密度为1.8149g/L)、 40g/L硼酸溶液、400g/L氢氧化钠、0.1000mol/L盐酸标 准溶液、混合指示剂 v混
6、合指示剂：1g/L甲基红乙醇溶液与1g/L亚甲基蓝乙醇溶液，用 时按2:1的比例混合；或者1g/L甲基红乙醇溶液与1g/L溴甲酚绿乙 醇溶液，用时按1:5的比例混合。 v5实验仪器 凯氏烧瓶（100mL或500mL）、可调式电炉、定氮蒸馏 装置。 10食品分析与检验技术 v四、相关知识 （一）食品中蛋白质含量测定凯氏定氮法原理 v 将被检样品加入浓硫酸，以硫酸铜、硫酸钾为催化剂共同加 热消化，食品中蛋白质分解为氨，并与硫酸结合成硫酸铵，通过 碱化蒸馏，使氨分离出来，用硼酸吸收形成硼酸氨后，再用盐酸 标准溶液滴定，根据消耗的标准盐酸的体积，通过换算系数，可 测定食品中蛋白质含量。 v 本法摘自G
7、B 5009.5-2010，适用于所有动、植物食品的蛋白 质含量测定。 11食品分析与检验技术 v（二）样品消化反应过程 1样品消化、蒸馏、滴定反应过程 消化反应方程式： v 2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O v 2H2SO4+CCO2+SO2+H2O v H2SO4+2NH3(NH4)2SO4 蒸馏反应方程式： v(NH4)2SO4+2NaOH2NH3+Na2SO4+2H2O 吸收与滴定： v2NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5H2O v(NH4)2B4O7+5H2O+2HCl2NH4Cl+4H3BO3 12食品分析与
8、检验技术 v2加快食品消化反应 （1）硫酸钾：硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物分解，它与 硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，反应方程式为： vK2SO4+H2SO42KHSO4 v2KHSO4K2SO4十SO2十H2O （2）硫酸铜：起催化剂作用，使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸 钾等作为氧化剂以加速有机物氧化，硫酸铜的作用机理如下所示： v2CuSO4Cu2SO4+SO2+O2 vC+CuSO4 Cu2SO4+SO2+CO2 v Cu2SO4+2H2SO42CuSO4+H2O+SO2 此反应不断进行，待有机物全部被消化完后，不再有硫酸亚铜 ( 褐色)生成，溶液呈现清澈的蓝绿色，故硫酸铜
9、除起催化剂的作用外 ，还可指示消化终点的到达。 13食品分析与检验技术 v（三）不同食品的蛋白质换算系数 v食品种类 F食品种类 F v小麦 5.83小麦粉及其制品 5.7 v大麦、燕麦、黑麦 5.83米 5.95 v花生 5.46大豆及其制品 5.71 v畜禽肉及其制品 6.25乳及乳制品 6.38 v芝麻、向日葵 5.4南瓜子 5.4 v栗子、胡桃 5.3其他食品 6.25 14食品分析与检验技术 v（四）注意事项 1蛋白质含量测定，因样品中常含有核酸、生物碱、含 氮类脂以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故结果 称为粗蛋白质含量。 2为减少实验误差，所有试剂溶液应用无氨蒸馏水配制 。 3
10、消化过程要不断转动凯氏烧瓶，以利于附着在瓶壁上 的固体残渣洗下，促进其消化；同时为防止造成氮损失 ，不要用强火，应保持缓和沸腾。 4样品中含脂肪或糖较多，消化过程中易产生大量泡沫 ，为防止泡沫外溢，在消化开始时用小火加热，并时时 摇动，也可以加入少量辛醇、液体石蜡或硅油消泡剂， 并控制热源强度。 15食品分析与检验技术 5一般消化至呈透明后，继续消化30min即可,有机物如分解完全， 消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。 6当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过 氧化氢23mL后继续加热消化。 7蒸馏装置应该密封，防止漏气，蒸馏过程中不得停火断气，防止 发生倒吸
11、； v消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，说明蒸馏前加碱量不足，要再增加 氢氧化钠用量；蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提高液面清洗管口，再 蒸馏1min而后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。 9硼酸吸收液的温度不应超过40，否则对氨的吸收作用减弱而造 成损失，此时可置于冷水浴中。 10混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸 性溶液中呈红色。 16食品分析与检验技术 v五、测定食品中蛋白质的方法 （一）食品中蛋白质的意义 v测定食品蛋白质的含量有利于评价食品的营养价值， 合理开发利用食品资源，同时对于提高产品质量、优 化食品配方具有重要意义 17食品分析与检验技术 v食品蛋白质测定方法
12、 测定方法 v利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量 ； v利用蛋白质中特定的氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团 等测定蛋白质含量。 凯氏定氮法作为国家标准检测蛋白质的方法，是目前最 常用的方法，是测定总有机氮最准确和操作简便的方法 之一. 双缩脲法，染料结合法，紫外线吸收法，酚试剂法等 采用红外检测仪对蛋白质进行快速定量分析。 18食品分析与检验技术 v(二)双缩脲法 当脲被小心加热至150160时，两分子间脱去 一个氨分子形成双缩脲，双缩脲在碱性条件下，能与硫 酸铜生成紫红色配合物，称为双缩脲反应，由于蛋白质 分子中有肽键(CONH)，与双缩脲结构相似，故 也能呈现此
13、反应而生成紫红色配合物，在一定条件下其 颜色深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸收光度法来 测定蛋白质含量，该配合物的最大吸收波长为560nm。 19食品分析与检验技术 v1标准曲线的绘制 以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样品。 按蛋白质含量40、50、60、70、80、90、100、110mg分别称取混 合均匀的标准蛋白质样于8支50mL纳氏比色管中，然后各加入1mL 四氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液 (或)准确稀释至50mL，振摇 10min，静置1h，取上层清液离心5min(2000r/min)。 取离心分离后的透明液于比色皿中，在560nm波长下以蒸馏水作参 比液，调节仪器
14、零点并测定各溶液的吸光度值 以蛋白质的含量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。 20食品分析与检验技术 v2样品的测定 准确称取样品适量 (即使得蛋白质含量在40 110mg)于50mL纳氏比色管中，加1mL四氯化碳 ，按上述步骤显色后，在相同条件下测其吸光度 值。用测得的吸光度值在标准曲线上可查得蛋白 质毫克数，由此求得蛋白质含量。 21食品分析与检验技术 v3结果计算 v式中 vX样品蛋白质含量，mg/100g。 vm由标准曲线上查得的蛋白质含量，mg； vm1样品质量，g。 v4试剂 碱性硫酸铜溶液、氯化碳。 v5仪器 分光光度计、离心机。 22食品分析与检验技术 v6注意事项 （1
15、）蛋白质的种类不同，对发色程度的影响不大。 （2）标准曲线做完整之后，无需每次再做标准曲线。 （3）含脂肪高的样品应预先用醚脱脂。 （4）样品中有不溶性成分存在时，会给比色测定带来困难，此时 可预先将蛋白质抽出后再进行测定。 （5）当肽链中含有脯氨酸时，若有多量糖类共存，显色不好，测 定值偏低。 （6）本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测 定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物 种籽及肉类等样品测定 23食品分析与检验技术 项目二：测定食品中氨基酸态氮 v一、案例 v二、选用国家标准 GB/T5009.39-2003酱油卫生标准的分析方法甲醛 值法。 24食品分析与检验技术 v三、测定方法 1分析步骤 v（1）吸取酱油5.0mL于100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释在至刻度 ，吸取混匀液20.0mL于200mL烧杯中，加水60mL，开动磁力搅 拌器，用0.050mol/L氢氧化钠滴定至酸度计指示pH为8.2，记录 消耗氢氧化钠标准溶液体积。 v（2）将烧杯中继续加入10.0mL36%甲醛，混匀后用氢氧化钠标 准溶液继续滴定至pH9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液体积。 v（3）做空白实验，取实验用水80mL，其余步骤同上，记录消耗 氢氧化钠标准溶液体积。 25食品分析
