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1、化学发光、荧光、可见光成 像分析系统原理及操作 一、结构配置 1、CCD 2、镜头 3、暗箱 （光源和滤光片） 4、软件 CCD的重要参数 、分辨率和总像素 、灰阶和动态范围 、像素大小 、信噪比和制冷 镜头的参数 、视野大小 、光圈系数 、定角VS变焦 、手动VS自动 3、暗箱 Camera UV Transilluminator Emission Filter Wheel Chromalight Excitation filter Epi UV Epi UV Sample UV-blue conversion screen Wight light plate Epi UV-blue con
2、version screen 根据应用选择配置 应用范围 、可见光 、荧光 、化学发光 （） 可见光 应用： 蛋白胶（Coomassie blue），银染核酸胶，细胞，菌 落计数，放射自显影 配置： 光源：透射白光，反射白光（可见光源 400-700nm ） 滤光片：Interference Filter 595nm，或者指定滤光片 镜头：变焦镜头 F0.95 CCD：常温CCD 可见光 Coomassie Protein GelSilver Stains Colony Plateflask （）荧光 应用： 荧光染料凝胶成像；荧光染料芯片扫描；荧光标记斑点杂交；多色western 荧光原理：
3、 荧光物质吸收特定波长的光能量（能量高 ），从基态(S0)成为激发态(S1)；被激发的 分子通过内部转化失去能量并回到基态； 同时发出波长更长的光（能量低） 配置： 光源：透射UV，反射UV，蓝光，多波长激发光源 滤光片：EB 595nm，或者根据发射荧光的波长而定 镜头：变焦镜头 F0.95 CCD：常温CCD 或制冷CCD（曝光时间长的弱荧光） 荧光 GFP SYBR green EB Multicolor Westerns （）化学发光 应用： Western blotting，northern blotting，southern blotting， Dot/Slot Blotting
4、原理： 化学反应的能量把体系中共存的某 种分子从基态激发到激发态从而产 生发光的现象。 配置： 样品板：高低两个位置，高位能够提高光线收集的效率 镜头：大光圈 CCD：制冷CCD 化学发光 Northern Blotting Southern Blotting Dot/Slot Blotting Western Blotting Macroarrays Microtiter Plates 发发发发光底光底 物物 二抗二抗 辣根辣根过过过过 氧化物氧化物酶酶 X光片 CCD相机 胶 电泳 PVDF 膜 转膜 一抗一抗 Western blotting化学发光 Western Blotting基本
5、原理 及 实 验 步 骤 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而 后利用相应的探测手段来检测样品的一种方法 对DNA的印迹分析称为Southern印迹法 对RNA的印迹分析称为Northern印迹法 单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印 迹法 双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法 什么是印迹？ Western Blot基本原理 l 在电场的作用下将电泳分离的 多肽从凝胶转移至一种固相支持体 ，然后用这种多肽的特异抗体来检 测 Western Blot应用 目的蛋白的表达特性分析（磷酸化？泛素化？裂解？） 目的蛋白与其它蛋白的相互作用（免疫共沉
6、淀） 目的蛋白的组织定位（胞核、浆、细胞器分离检测） 目的蛋白的表达量分析 仪器与设备 低温超速离心机 分光光度计或Nanodrop 电泳仪 垂直式电泳槽 电转系统 成像系统 Western Blot 流程 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 转膜 封闭 抗体杂交 底物显色 成像 蛋白样品的制备 蛋白样品的提取 组织 细胞 细菌 蛋白样品的定量 Bradford法，Lowry法 Nanodrop 等仪器直接检测定量 其他定量方法 凝胶成分 M丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 M10%SDS M不同PH值的Tris缓冲液（PH6.8浓缩胶用, 8.8分离 胶用） MTEMED M10%过硫
7、酸铵（AP） M纯水 设计 根据需要检测的蛋白分子量大小选择配制合适浓度 的分离胶，再根据需要上样的数量选择适当齿数的梳子 制胶 先铺分离胶，干凝后，倒去上面的水（或甲醇）， 用滤纸吸干。再铺浓缩胶，不要产生气泡，插梳子，待胶 干后备用 上样 拔去梳子，所有上样孔均加样。没有样本时，用上 样缓冲液代替 电泳 一般100-150V，溴酚蓝快要跑出胶时结束 电泳 参照体系 分子量Marker：确定蛋白条带的分子量 已知量标准产物的正对照 空白载体对照：如果是检测载体表达蛋白，需要检测表 达前的蛋白样品 内参：看家基因编码表达的蛋白 转膜方式 半干法 时间短、节省电转液。 湿法 费时、相对温和一点的
8、转移方法。 转膜 小心取下凝胶，切除浓缩胶，并在分离胶的 第一泳道处切角作标记。把预先在转膜缓冲液中 平衡过的滤纸及膜切成与凝胶同样大小，按次序 叠放在一起，即从阴极至阳极依次是：滤纸、胶 、膜、滤纸。 封闭除去非特异的结合位点 S脱脂奶粉 SBSA S生物试剂公司提供的膜封闭液 抗体孵育 一抗用量根据0.1ml/cm2膜计算，室温1-2小 时或者4度过夜（不同公司的抗体有不同的要 求，请仔细阅读说明书） 二抗用量也是0.1ml/cm2膜，一般室温反应1- 2小时 显色 辣根过氧化物酶法 化学发光显色法（胶片） 成像系统操作步骤 打开电脑，进入操作系统界面之后打开成像系统机箱 电源，然后双击电
9、脑桌面“FUSION”图标 等待CCD温度达到工作要求，成像系统工作界面出现 将事先准备好的蛋白印迹杂交膜置于透明塑料膜上， 滴上化学发光试剂，放入暗箱适当的高度 点击“Start preview”，待显示样品位置后，打开 FUSION机箱外门并调整样品位置使其处于成像界面 中央。根据需要调整光圈和焦距使图像效果达到最佳 。名片或其他印有字体的小纸片可用来获取最佳焦距 选择化学发光文件夹；选择最佳光圈；调整曝光时间 为自动曝光或者根据样品情况选择更合适的曝光时间 ；点击“Start Exposure”； 曝光结束后保存图像； 使用BIO-1D软件或IMAGE-J等软件对图像进行光密度 分析。
10、注意 信号很弱时，可手动调节延长曝光时间，也可采用累 加功能 使用荧光抗体时，成像设置的时候选择“荧光”模式 ，并选择适当的激发光源和滤光片。曝光方法与化学 发光相同 希望在同一张膜同时检测多个抗体时，使用量子点试 剂或者荧光抗体，用荧光模式成像。每次成像后可将 不同抗体的成像赋与不同的伪彩，最后将图像叠加 1- Acquisition Go to the Image capture menu 2- Open Open an image 3- Save Save an image 4- Print Print on the default printer (if connected) 5- C
11、rop Select the image area to be saved 6- Profile out Save and retrieve the user setting 7- Help Open the Help file on a specific function The Fusion-Capt software offers three image acquisition modes: Fluorescence mode for full control of gel image capture ; Chemiluminescence mode for a one click ap
12、proach to image capture of low light sample; Video mode for repetitive image acquisition with or without image accumulation. In addition to that, the Fusion-Capt software has analysis and parameters modes. Each mode is gathered in a specific folder: Modify the display of the image (autoscale, invers
13、e, saturation, gamma and greyscale selection to enhance the image display) Enhance the image 1- Position & focus Start preview: view a real time preview of your image capture. Stop: end the real time preview. Aperture: select the appropriate aperture to receive more or less light Focus: adjust the f
14、ocal point Autofocus: automatically adjust the focal point Focus gauge: the focus gauge is an aid in focusing. 2- Image capture Exposure time: modify the exposure time to enhance the signal. Stop exposure: capture the last image view for further saving, analysis or enhancement. Auto-exposure: The au
15、tomatic mode allows an automatic calculation of the exposure time. 3- Set-up menu Modify the display of the image (autoscale, inverse, saturation, gamma and greyscale selection to enhance the image display) Enhance the image 凝胶成像分析系统 Gel documentation and gel analysis system 凝胶成像分析系统简介 BIO-PROFIL ，V
16、ilber Lourmat,France 1. CCD摄像头：单色带积分时间，超级像素分辨率752(高）582（宽 ），超高灵敏度：10-5 Lux，配12.575/1.8变焦镜头及专用UV/IR 干涉滤光片。 2.多功能暗箱: 具有自动滑道，方便紫外与白光转换，开门有自动保 护开关，防止紫外光对人损伤。 3.紫外/白光灯箱: 具有20*20cm*2特大滤光片，紫外光可进行EB染 色、核酸分析，白光可进行银染、考马斯靓蓝等蛋白分析，特有 冷却系统，超长寿命滤光片。 4.高清晰度图像卡和BIOCAPT软件 图像具有多种输出/输入规格如TIFF、BitMap、 JEPG/PICT/PCX/GIF/ 可加注时间和说明 可进行对比度、亮度调节、并对图示图像进行旋转、正/负片和 倒置处理 分子量计
