蛋白质的提取与分离纯化综述

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1、1 第五节第五节 层析分离层析分离 层析法也称色谱法，是1903年俄国植 物学家Michael Tswett发现并命名的。 将植物色素溶液通过装有CaCO3吸附剂的 柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以 不同的速率流动后形成不同的色带而被 分开。 2 一、吸附层析（adsorption chromatography ） 1、原理 利用吸附剂对不同组分的吸附力不同进行 分离。 3 1、原理 吸附作用的强弱主要与吸附剂和被 吸附物质的性质有关。 吸附层析的关键：吸附剂和洗脱剂 的选择。 一、吸附层析 4 2 2、洗脱方法、洗脱方法 l溶剂洗脱法 l置换洗脱法 l前缘洗脱法 一、吸附层析 5 3.吸附

2、剂 吸附剂通过范德华力、静电引力、疏水作用等与待 分离物质的极性官能团作用。 1）吸附剂的选择： 根据吸附能力强弱分为： 弱吸附剂：蔗糖、淀粉 中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等 强吸附剂：氧化铝、活性炭 一、吸附层析 6 吸附剂的选择根据相似相溶原则： 极性强的吸附剂易吸附极性强的物质 非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。 但为了便于解吸附，对于极性强的物 质通常选用极性弱的吸附剂进行吸附。 一、吸附层析 3、吸附剂 7 4、洗脱剂 要求： 粘度小，纯度高，稳定性好，完全洗脱下 所要分离的成分,易与目标分子分离。 选择： 具有较高洗脱能力的洗脱剂作为流动相。 生物大分子一般选择中性盐溶液为洗脱

3、剂。 一、吸附层析 羟基磷灰石 羟基磷灰石Ca5(PO4)3OH2，简称HA的吸附容量高，稳 定性好(在T85，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制备及纯 化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命物质方面得到了广泛 的应用。有时有些样品如RNA、双链DNA、单链DNA和杂合型双 链DNA-RNA等，经过一次HA柱层析，就能达到有效的分离。 HA的Ca2+基团和生物分子表面的负电荷基团的相互反应 ，在用HA分离生物分子过程中起着重要作用。而HA的PO43-基 团与生物分子表面的正电荷基团的相互反应，则仅起着次要 的作用。 使用HA作为固定相基质的注意事项： (1) HA系干粉时，要先在蒸馏水中浸泡

4、，使其膨胀度(水 化后所占有的体积)达到2-3mL/克后，再按16体积加入缓冲 液悬浮，以除去细小颗粒； (2) HA悬浮液须用旋涡振荡器混合，若用磁棒或玻棒搅 拌时，HA的晶体结构会被破坏； (3) 忌用柠檬酸缓冲液和pH5.5的缓冲液。当用过的HA 层析柱再生时，要先挖去顶部的一层HA，然后用一倍床体积 的1mol/L NaCl溶液洗涤，接着用4倍床体积的平衡液洗涤平 衡，如此处理后即可使用； (4) 就操作容量来说，一般细颗粒HA比粗的大。而从分 辨率比较，粗颗粒HA也没有细的好。 用细颗粒HA层析时，柱 子直径应大些才能达到满意的流速。 10 5、应用 分离纯化生物大分子 一、吸附层析

5、 11 二、二、分配层析 l分配层析是利用各组分在两相中的分配 系数不同，而使各组分分离的方法。 l分配系数是指一种溶质在两种互不相溶 的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两 项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确 定后，分配系数是一常数，用K表示。 12 在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（ 如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为固定 相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物 上。 另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相 流动，称为流动相。 当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在 两相之间进行连续的动态分配。 二、分配层析 13 1 1、纸上层析、纸上层析 l固定相：滤纸纤

6、维的结合水 l流动相：与水不相混溶或部分混溶的有 机溶剂 二、分配层析 14 1 1、纸上层析、纸上层析 二、分配层析 15 三、离子交换层析 （ion exchange chromatography，IEC） 原理:根据待分离物质带电性质不同的分离 纯化方法。 16 1、离子交换剂： 离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。 如羧甲基纤维素离子交换剂组成 纤维素OCH2COO-Na+ 载体 电荷基团 反离子 三、离子交换层析 17 化学原料合成 ：树脂类物质 载体 天然材料制成： cellulose sephadex sepharose 阳离子交换剂: 电荷基团（）, 反离子（） 电荷基团

7、阴离子交换剂: 电荷基团（）, 反离子（） 如：DEAE-纤维素， CM-Sepharose 三、离子交换层析 18 离子交换剂 -带有电荷基团的不溶性载体 -O-CH2CH2N-H CH2CH3 CH2CH3 Cl- 载体 Diethylaminoethyl (DEAE) 阴离子交换剂 (可吸附带负电的蛋白质) 阳离子交换剂 (可吸附带正电的蛋白质) 19 两种离子交换剂两种离子交换剂 l阴离子交换剂： l常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基 l阳离子交换剂： l常用羧甲基 CM CH2COO l磺丙基 SP C3H6SO3 DEAE C2H4N+(C2H5)2H QAE C2H4N+(

8、C2H5)2CH2CH(OH)CH3 三、离子交换层析 20 类型说明功能基反离子 DEAE-Sephadex A-25 ，A-50 弱碱性阴离 子交换剂 二乙氨基己基氯 QAE-Sephadex A-25 ，A-50 强碱性阴离 子交换剂 二乙氨基己基 2-羟丙基 氯 CM-Sephadex C-25 ，C-50 弱酸性阳离 子交换剂 羧甲基钠 SP-Sephadex C-25 ，C-50 强酸性阳离 子交换剂 磺丙基钠 离子交换葡聚糖离子交换葡聚糖 21 离子交换剂的选择 a. 强、弱离子交换剂的选择： 强型：适用的pH范围广，制备无离子水 弱型：适用的pH范围窄，分离生物大分子物质 b.

9、 阴、阳离子交换剂的选择：蛋白质的稳定性 若pI稳定，蛋白质带负电荷，用阴离子交换剂 三、离子交换层析 22 2、蛋白质的电荷性质 三、离子交换层析 23 pH 值如何影响蛋白质的电荷数 2468101214 0 系统 pH + 蛋白质带正电荷 蛋白质带负电荷 等电点 - 24 3、实验设计原理 利用不同的蛋白质分子在溶液中所带电 荷不同，因而与离子交换剂有不同吸附力而 分离。 pH6.0 pI 6.0 蛋白质带正电pI 50 ） 2.蛋白质的浓度 （恰到好处） 浓度越高越易结晶，控制在饱和区以上， 过饱和区以下的介稳区内。 3. 结晶温度 4. 溶液pH 5.离子强度 6. 晶核 7.结晶时

10、间 172 （二）结晶的方法 1. 除去一部分溶剂，如蒸发浓缩使溶液达 到过饱和状态而析出晶体 ; 2. 不除去溶剂，而在溶液中加入沉淀剂， 如中性盐、有机溶剂等。 盐析法 如，前述的 有机溶剂法 均可用于结晶 等电点 173 常用的结晶方法：透析平衡结晶法 将蛋白质溶液装进透析袋，对一定浓度 的盐溶液进行透析，使酶液逐步达到过饱和 状态而析出结晶的过程。 前提：蛋白质溶液要达到一定纯度（经过纯 化）。 蛋白质溶液要浓缩到一定浓度。 第八节：蛋白质的分析鉴定 一、蛋白质理化性质测定 （一）蛋白质含量测定 （二）蛋白质相对分子量及等电点测定 （三）蛋白质纯度测定 二、蛋白质鉴定 （一）蛋白质免疫

11、印迹（Western- Blotting） （二）蛋白质序列分析 在蛋白质分离纯化过程中，需要对蛋 白质的含量和纯度不断进行检测，通过优 化纯化方法获得高含量、高纯度的蛋白质 产品，为蛋白质的结构、功能分析及产品 开发提供材料。 为了鉴定某种微量蛋白质在样品中的存 在，常采用蛋白质免疫印迹的方法，利用 抗原抗体的特异性来鉴定。 此外，还可测定蛋白质的氨基酸序列， 对其生物学功能进行鉴定等。 一、蛋白质理化性质测定 （一）蛋白质含量测定 （1）凯氏定氮：是最经典的蛋白质含量测定方法。 氮素含量除16，或乘6.25即为蛋白质含量。适于较纯 ，粗蛋白值偏高。 此法操作比较复杂，目前已不常用。 （2）

12、双缩脲法：快速不需十分精确。 原理：两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成紫红色络合物，540nm波 长最大吸收，值大小与蛋白质浓度成正比。 含有两个或两个以上 肽键的化合物，能发生同样的反应，肽键的反应，肽键越多颜色 越深 特点：受蛋白质特异性影响小 应用：蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度，测定范围在mg/mL作用 一、蛋白质理化性质测定 （一）蛋白质含量测定 （3）福林-酚法（Lowry）：多年被选为蛋白质标准 测定方法。 原理：蛋白质与双缩脲试剂形成络合物后，蛋白质中的酪氨 酸，色氨酸及半胱氨酸会使磷钼酸一磷钨酸还原生产蓝 色物质，在650nm最大吸收，与蛋白质浓度成正比。 特点：灵敏度比

13、双缩脲法提高10倍左右，缺点是试剂的配制 较为困难，费时间较长，很多物质对此法有干扰，比较 适合于较纯蛋白的含量测定。 （一）蛋白质含量测定 （4）紫外吸收法：此法简便快速。 通过测定样品的紫外吸收值，根据经验公式 或标准曲线也可以测定蛋白质含量。 此法测定简单，而且不破坏样品，样品测定后 可以再利用，缺点是样品中的核酸，高浓度缓 冲液等具有紫外吸收的物质会干扰测定，引起 实验误差。 （一）蛋白质含量测定 （5）考马斯亮蓝染色法（Bradford）：目前 应用最广。原理：考马斯亮蓝G-250在酸 性溶液中为棕红色，最大光吸收在488nm ，当它与蛋白质通过疏水作用结合后，变 为蓝色，在595n

14、m有最大吸收，大小与蛋 白质浓度成正比。特点：此法测定简单， 只要将蛋白质样品加到染料试剂中，即可 进行比色测定。其灵敏度与福林-酚法相 当，测定浓度范围在0.011.0mg/mL。高 浓度缓冲液、尿素、甘油、蔗糖、硫酸铵 等对测定有干扰。应用：该方法是目前应 用最广的蛋白质测定方法之一。 （6）胶体金测定法：是灵敏度最高的蛋白质 测定方法。 测定浓度范围为ng/mL水平。胶体金本身 呈洋红色，与蛋白质结合后转变为蓝色， 颜色深浅与蛋白质浓度成正比，缺点是成 本较高。 （一）蛋白质含量测定 （6）胶体金测定法：是灵敏度最高的蛋白质测定 方法。 胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗

15、坏血 酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的 金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态， 形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定 的胶体状态，故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负 电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合 ，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生 物特性。测定浓度范围为ng/mL水平。胶体金本身呈洋 红色，与蛋白质结合后转变为蓝色，颜色深浅与蛋白 质浓度成正比，缺点是成本较高。 （二）蛋白质相对分子量及等电点测定 分子量目前常用： 1、分子筛层析法：可以测定活性多亚基蛋白质的相 对分子量。 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳：也可测定活性多亚基蛋白 的相对分子

16、量，但由于蛋白质的迁移率还受到分 子形状、所带电荷等的影响，因此测定的分子量 不够准确。 3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：测定变性蛋白质中单 亚基相对分子量的最有效最常用的方法。 4、此外，还可以根据蛋白质特殊元素组成计算法、 氨基酸序列推导法、渗透压法、沉降法、质谱法 等。 （二）蛋白质相对分子量及等电点测定 蛋白质等电点： 等电聚焦电泳法主要方法，通过等电点沉淀 可以测定蛋白质等电点的大致范围，通过蛋白质 氨基酸序列以可直接预测蛋白质的等电点。 （三）蛋白质纯度测定 1、色谱法：如HPLC 如果制备蛋白酶，需要利用的是蛋白酶的 活性，只要其中的杂质不影响酶的活性即 可，此时可以利用柱层析表示其纯度，在 特定条件下，层析图谱只有一个或少数几 个洗脱峰，也就是达到了色谱纯，可以满 足常规的酶活分析等。如果通过结晶与再 结晶的方法纯化蛋白质，则得到的蛋白质 则为结晶纯，获得的晶体可用于蛋白质三 维结构分析。 。 （三）蛋白质纯度