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1、药敏试验及2010年CLSI更新 华中科技大学同济医院 朱旭慧 细菌耐药性变迁G+ 金葡菌 MRSA VISA VRSA CA-MRSA 青霉素不敏感肺炎链球菌 PISP PRSP 耐万古肠球菌 VRE（vanA vanB vanC） 肠杆菌科细菌 大肠、肺克、奇异变形杆 菌产ESBLs，AmpC酶等 大肠埃希菌耐FQ 耐第三代头孢、碳青霉烯类革兰阴性杆菌 多重耐药及泛耐药菌不动杆菌属、绿脓 、肠杆菌科细菌中的某些种 细菌耐药性变迁G - 细菌药敏试验的重要性 细菌耐药性仍呈增加趋势 加强对耐药菌的检测、耐药菌带菌者的筛 查和耐药机制研究 正确合理选用抗菌药和控制耐药菌感染 正确的药敏试验及报
2、 告非常重要！ 如何进行药物敏感性试验？ 纸片扩散法 Kirby-baure(K-B)法） 稀释法 试管稀释法（肉汤稀释法 平板稀释法（琼脂稀释法） E-Test 细菌报告应注意的问题 有无细菌：苛养菌、难培养细菌 正常菌群/病原菌:病史、病人体征、感染部位 药敏结果报告：耐药菌株的提示或修改 完全抑制的抑菌圈直径，包括纸片的直径 不反光的黑色背景、反射光下阅读结果 抑菌圈的界限应该是以肉眼观察没有明显 的可见细菌生长区域 在抑菌圈边缘微弱生长的、仅能在放大镜 下才能观察到的细小菌落应忽略 正确阅读纸片法结果 正确阅读抑菌圈内的“霾”现象 变形杆菌(迁移生长)以及磺胺类药物的纸片法药敏 注意要
3、读 完全抑制的抑菌圈，对“霾”生长不予理会 克林霉素对葡萄球菌的抑菌圈内如有薄雾状菌苔应报告细菌 对克林霉素耐药,不管其是否显示 “D”抑菌圈 需在透射光（Transmitted light）下阅读万古霉素、利奈唑胺 和苯唑西林的抑菌圈，遇不敏感的结果需用稀释法测定MIC 法确证 E-test试验结果阅读 忽略溶血，读取生长完全被抑 制处 MIC 0.032ug/ml 杀菌型药物如氨基糖苷类产 生“干脆利落”椭圆球 MIC 0.064ug/ml 试条两边产生不同的交界点 ，读取较高数值侧的MIC。 如果两侧差1个稀释度，则 须重复试验。 MIC 0.5ug/ml 忽略变形杆菌的迁延现象 ，MI
4、C 0.064ug/ml 哪些需要做MIC 肺炎链球菌 苯唑西林纸片法直径19mm,需要明 确受试菌对青霉素的敏感性，必须做青霉素的E- 试验 革兰阳性球菌 万古霉素不敏感时（中介或耐药 ），必须做万古霉素的E-试验确认受试菌对万古 霉素的敏感性（包括替考拉宁、利奈唑胺等） 草绿色链球菌 对青霉素、氨苄西林 纸片法药敏结果不可靠，必须做上述 两药的E-test 葡萄球菌：某些情况下，对万古霉素 纸片法的分辨率低 Clinical Infectious Diseases 2007; 44:153642 万古霉素的MIC方法为常规药敏试验的方法 2009 2008 2009年取消了万古霉素对葡萄球
5、菌纸片法药敏 增加万古霉素剂量不能改善临床疗效 大剂量万古霉素治疗医院获得性MRSA感染， MIC=2g/mL仍导致高治疗 失败率 Hidayat LK et al. Arch Int Med. 2006;166:2138-2144. 一项单中心、前瞻性研究，对95例罹患医院MRSA感染的住院或住护理院的老年患者静脉滴注万古霉素，对临床疗效、死亡率、肾毒性 进行评价 *到达目标：万古霉素血浆谷浓度达到15-20g/mL；治疗反应：患者发热、白细胞增多症状部分或完全缓解 0% 20% 40% 60% 80% 100% 治疗反应 (%) P=0.02 85% 62% 总体 MIC 1MIC=2 到
6、达目标*未到目标 耐青霉素肺炎链球菌的检测 苯唑西林：1ug/片 抑菌圈直径20mm为青霉素敏感株（ MIC0.06ug/ml ） 抑菌圈直径19mm可能为青霉素耐药、中敏 或敏感株，必须进行青霉素MIC测定。 肺炎链球菌对青霉素药敏试验的判断标准 (mcg/ml) 2008版！ M100-S18 Table 2G敏感 中介 耐药 青霉素（非脑膜炎）248 青霉素（脑膜炎） 0.06-0.12 青霉素（口服青霉素 V） 0.060.12-12 2007版 ! M100-S17 Table 2G 青霉素 0.060.12-12 对于三个青霉素的判断标准我们都应该解 释和报告吗？ 青霉素判断标准
7、解释/报告？ 脑膜炎 是的，脑脊液标本 非脑膜炎 是的，其他的标本，因为我们通常不 能确定该感染是否涉及脑膜 口服青霉素V 可能不需要，如果你们实验室不用口 服青霉素（阿莫西林经常被用做口服 青霉素的首选） 不可能出现的药敏结果 同一株细菌不可能出现的矛盾的药敏结果 金葡菌：青霉素S，苯唑西林R；万古霉素R 肠球菌：万古霉素S，替考拉宁R 肠杆菌科细菌：第三代头孢菌素R，第二、 第一代S CLSI附录E（Appendix E)指出的少见或 罕见的结果 如遇到上述菌株必须重新鉴定细菌和药敏！ 2010CLSI主要更新内容 肠杆菌科相关的更新 葡萄球菌属相关的更新 其他菌种相关的更新 表1和表2介
8、绍内容中的更新 2010CLSI主要更新内容 主要格式的更新 关于药敏质控的更新（新增Doripenem等质控范围） 关于药敏试验操作的更新 脆弱拟杆菌的累积药敏报告 术语表的更新（新的抗生素亚组-抗MRSA活性的头孢菌素） 肠杆菌科新旧折点(MIC ug/l） AgentCLSI M100-S19CLSI M100-S20 SIRSIR 头孢唑啉81632 124 头孢噻肟 816-3264 124 头孢唑肟816-3264 124 头孢曲松 816-3264 124 头孢他啶 81632 4816 氨曲南 81632 4816 肠杆菌科新旧折点(纸片扩散法，mm) AgentCLSI M1
9、00-S19CLSI M100-S20 SIRSIR 头孢唑林* 1815-17 14NANANA 头孢噻肟 2315-22 14 2623-25 22 头孢唑肟 2015-19 14 2522-24 21 头孢曲松 2114-20 13 2320-22 19 头孢他啶 1815-17 14 2118-20 17 氨曲南 2216-21 15 218-20 17 *纸片扩散法折点标准还未建立 CLSI M100CLSI M100-S20. Table 2A. 已评估但未修正的肠杆菌科药敏折点 药物CLSI M100-S20(2010) SIR 头孢呋辛（ 非口服） 81632 头孢吡肟816
10、32 头孢替坦1632 64 头孢西丁816 32 CLSI M100CLSI M100-S20. Table 2A. 为什么CLSI降低了头孢菌素及氨曲南的折点 以前的折点标准建立于20年前（ESBLs以前） 老的和新的-内酰胺酶耐药机制等相关知识 的增加 -ESBL问题的复杂化；多种酶导致ESBL检测的准确性降低 新的建立折点标准工具的出现 -PK/PD知识的增加 为什么头孢唑啉没有纸片扩散法折点？ 修订的MIC折点与相关的抑菌圈直径标准尚未确 立 需要进一步的研究 可能需要使用一种改变含药剂型的新型纸片 ESBLs检测（1） 最初的建议*是基于： -研究观察到某些产ESBLs菌株，药物的
11、MICs有 升高但仍然在敏感区（旧折点） -有限的临床观察发现，对于产ESBLs菌株引起的 感染，病人预后差。 ESBLs试验建议是处理一个新型耐药机制 的短期解决方案 ESBLs检测（2） 多重耐药机制的出现可能会使ESBL确证实验受阻 -ESBL+AmpC -ESBL+孔蛋白突变 ESBLs产生于肠杆菌科细菌，而不仅仅是大肠埃希菌、克雷 伯菌属和奇异变形杆菌,对于其他的菌株确证实验则存在许多 问题 与“R”机制相比，MIC与临床预后具有更好的相关性。 CLSI ESBL 检测建议 以往的折点M100-S19修订后的折点M100-S20 临床报告 ESBL初筛及确证试验YesNo 头孢菌素类
12、、青霉素类和氨曲 南等药物将“S”修改为“R” YesNo 感染控制和流行病学调查 ESBL初筛及确证试验Yes,假如需要的话Yes,假如需要的话 头孢菌素类、青霉素类和氨曲 南等药物将“S”修改为“R” YesNo 未被CLSI重新评估的折点 头孢孟多 头孢尼西 头孢哌酮 拉氧头孢 在USA这些药物通常是不可行的或为被使用 假如使用这些药物的话，我们必须继续在大肠埃希 菌、克雷伯菌属和变形杆菌中做ESBL初筛及确证实 验 -ESBL阳性，将头孢菌素类、青霉素类和氨曲南等药物 “S” 修改为“R” MRS的结果报告原则 MRSA和MRCNS菌株对-内酰胺类药物，如青 霉素类、 -内酰胺/ -内
13、酰胺酶抑制剂、 头孢类（除外新型的有抗MRSA活性的头孢菌 素，如Ceftaroline 、Ceftobiprole ）以及 碳青霉烯类体外敏感但临床无效，均需报告 为耐药 葡萄球菌属相关的更新葡萄球菌属相关的更新 增加的MRSA的定义 “MRSA是指表达mecA基因或其它甲氧西林耐药机制 (如青霉素结合蛋白对苯唑西林亲和力改变等）的金 黄色葡萄球菌 CLSI M100CLSI M100-S20. pp. 60 MRSA=表达mecA基因 和/或 苯唑西林MIC2 g/ml 金黄色葡萄球菌或路登葡萄球菌检测苯 唑西林（OX）和头孢西丁（FOX） “头孢西丁被作为苯唑西林耐药的替代药物； 报告苯
14、唑西林敏感或耐药是基于头孢西丁的 结果。假如头孢西丁和苯唑西林都被用于测 定金黄色葡萄球菌或路登葡萄球菌，那么两 种药物中任一种耐药，该菌株即应被报告为 对苯唑西林耐药。” CLSI M100CLSI M100-S20. pp. 62. 金黄色葡萄球菌或路登葡萄球菌检测苯 唑西林（OX）和头孢西丁（FOX） OXFOX耐药机制相对流行率 OX报告 SSNone一般S RRmecA一般R RSmecA（低水平表达）少见R* SRPBP改变或-内酰胺 酶的高表达（模糊的 MRSA） 罕见R* 葡萄球菌属:诱导性-内酰胺酶试验 青霉素 MIC0.12mg/L 抑菌圈直径29mm 诱导性-内酰胺酶试验
15、 对于严重感染，随后分离出的菌株，实验室应进行 青霉素的MIC检测和-内酰胺酶诱导试验 -内酰胺酶的诱导试验 苯唑西林 (诱导剂） 菌种划线(BAP、MHA) 贴-内酰胺类纸片(OXA、FOX) 过夜培养 检测抑菌圈边缘的菌落 葡萄球菌属葡萄球菌属 青霉素青霉素 MIC0.12mg/LMIC0.12mg/L 抑菌圈直径抑菌圈直径 29mm29mm 葡萄球菌属-D试验 1526mm erm 基因编码的23S rRNA 甲基化 报告评论: “由于克林 霉素诱导耐药试验阳 性,推测此菌株对克 林霉素耐药,但在少 数患者治疗中克林霉 素可能仍有效”。 修订的建议 Re：万古霉素MIC,什么时候葡萄球菌应该被 送到一个参考实验室做进一步检测？ 金黄色葡萄球菌 -MIC 4g/mlMaybe -MIC8g/mlYes 凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS） - MIC32g/mlYes 葡萄球菌属利奈唑胺 增加的“R”折点 方法CLSI M100-S19 (2009) CLSI M100-S20 (2010) SIRSIR MIC(ug/ml）4-4-8 抑菌环直径（mm）21-21-20 对利奈唑胺不敏感的的金葡较少，占0.05%（7/15280）。 CLSI agenda book June 2009 耐药机制已被识别 -rRNA突
