细胞培养基础知识教材

《细胞培养基础知识教材》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞培养基础知识教材（73页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、WALVAX Introduction 玉溪嘉和生物药业有限公司 1 细胞培养基础知识 王建清 内容 单抗基本知识 细胞基本知识 设备与器材准备、溶液配制 无菌技术 细胞培养 细胞计数 冻存、复苏 2 抗体基本概念及抗体结构 抗体基本概念 B细胞接受抗原刺激后增 殖分化成浆细胞产生的糖 蛋白 抗体的结构 四条肽链通过链间二硫键 组成H2L2 重链：五类(isotype: a、g 、m、d、e) 轻链：两型(k、l) 3 抗体基本概念及抗体结构 抗体的三个功能区 n 可变区(Variable region, VH/VL, Fv)：结合抗原 VH和VL：重链 可变区与轻链可变区 高变区 HVR 抗

2、原结合部位互补 决定区CDR 骨架区 FR14 n 恒定区(Constant region, CH/CL) n 绞链区(Hinge region) 4 抗体基本概念及抗体结构 免疫球蛋白的类型 类型(Class): 重链 C区抗原性 IgG、IgA 、IgM、IgD、IgE 亚类(Subclass): 重链抗原性/二硫键 数目位置 IgG1-4 5 单克隆抗体和基因工程单抗 6 单克隆抗体和基因工程单抗 人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒 定区融合而得到的抗体。定区融合而得到的抗体。 7 鼠单克隆V区人源化（CDR移植） CDR序列 C

3、DR序列 鼠单克隆抗体 人抗体 人源化抗体 单克隆抗体和基因工程单抗 8 鼠抗体 嵌合抗体 66% 人源化抗体 90% 全人抗体100% 单克隆抗体和基因工程单抗 9 单抗基本知识 细胞基本知识 设备与器材准备、溶液配制 无菌技术 细胞培养 细胞计数 冻存、复苏 10 细胞基础知识 细胞学的由来 细胞及细胞学说的提出：1665年英国学者Robert hooke，用自制 的显微镜观察软木的薄片，第一次发现植物的细胞结构，并首次 借用拉丁文Cella（小室）这个词称呼他们看到的类似于蜂巢的 极小的封闭小室。德国植物学家施莱登（1838.M.J S chleiden ）,动物学家施旺（1839，T.

4、schwann）提出动植物都是细胞的集 合物。使细胞及其功能有了一个较为明确的定义，确立了“细胞 学说”的基本原则。这时“细胞学说”主要内容是：（1）细胞 是有机体，动植物都是由细胞发育来的；（2）每个细胞都作为 一个相对的独立单位，有自己的“生命”（3）新的细胞可以通 过老的细胞繁殖产生。 11 细胞基本知识 细胞的基础知识 1、细胞是生命活动的基本单位：细胞是生命活动的基本单位， 一切机体均由细胞构成（病毒是非细胞形态的生命）。细胞不仅 是机体的基本形态机构单位，也是机体的基本功能单位，机体的 生长、发育、繁殖和进化都是以细胞为基础。细胞同时也是机体 发生疾病的基础。 2、细胞的基本共性：

5、构成细胞的基本化学因素只O、C、H、N、P 、S、Ca、K、Fe、Na、Cl、Mg等，他们构成细胞功能与结构所需 的许多无极化合物和各种生物分子。构成细胞结构的基本生物大 分子是：核酸、蛋白质、脂肪和糖类。这些大分子一般以符合分 子形成如核蛋白、脂蛋白、糖蛋白或糖脂等组成细胞的重要结 构。 12 3、细胞的基本结构 在亚显微结构水平上，细胞基本结构 大体可以分成三种体系：主要由脂蛋 白构成的生物膜系统，如细胞膜、核 膜及一系列重要细胞器如：线粒体、 高尔基体、内质网、溶酶体和液泡等 的封闭膜；第二类主要由核酸蛋白成 分构成的颗粒与显微结构系统，如染 色质与核仁基质，核蛋白体等；第三 类有蛋白质

6、构成的细胞骨架（主要是 微丝与微管），中心体、纺锤体、纤 毛、鞭毛等专门结构。 细胞基本知识 1. 核仁 2. 细胞核 3. 核糖体 4.囊泡5.粗 面内质网 6. 高尔基体 7. 细胞骨架 8. 滑 面内质网 9. 线粒体 10. 液泡 11. 细胞质 12. 溶酶体 13. 中心粒 13 4、细胞作为生命活动的基本单位的共同特点：首先所有细胞表面均 有一层脂蛋白成分的生物膜，使细胞能与周围环境保持相对独立性： 其次所有细胞都有两种核酸，即DNA和RNA作为遗传信息的复制和转 录的物质基础；第三作作为蛋白质合成的“机器”-核蛋白，是一切细胞 不可缺少的基本结构；第四所有细胞都是以一分为二的分

7、裂方式增 值。第五细胞具有多样性，形状、大小、悬殊很大，结构复杂程度也 很不一样。 5、原核细胞与真核细胞：这两种细胞是根据进化程度与结构的复杂 程度来划分的。原核细胞（Procarytic cell）它没有典型的核结构，没 有核膜，只有一个比较集中的核区，其中分布着环装DNA丝，细胞内 缺少重要细胞器，但有时有核蛋白体及游离的质粒（plasmid），原核 细胞的繁殖以直接分裂（无丝分裂）为主，DNA复制、RNA转录与蛋 白质合成同时连续进行。 细胞基本知识 14 6、从进化角度真核细胞与原核细胞有两点区别，第一细胞膜系统的分 化与演变不同。真核细胞以膜系统的分化为基础，分化成各种重要的 细胞

8、器；第二遗传信息与遗传装置的扩增与复杂化程度不一。真核细 胞（Eucaryotic cell）进化程度高，结构相当复杂。 细胞基本知识 15 细胞周期（细胞分裂 周期）即单个细胞的生长 过程，指母细胞分裂后形成 的细胞到下一次再分裂成两 个子细胞之间的时期。细胞 的增殖是生物最根本的特征 ，细胞是借助分裂来进行增 殖的。通过细胞分裂即可将 复制的遗传物质平均地分配 到两个子细胞中。 我们进行体外细胞培养，实际是在细胞群体和个体的情况下考查细胞行为的。大部分细 胞群体都由分裂和不分裂两部细胞混合组成。而不分裂细胞又可分为两类：即保持再进 入细胞周期能力的G0期细胞（或叫静置细胞或休止细胞）及不分

9、裂最终注定要死亡的终 止分化细胞（或称之终端分化细胞），他们不能再进入周期。进入周期内的细胞可以分 为两个期：间期（G1+S+G2），M期（有丝分裂期），整个细胞周期组成是G0+G1+S+G2+M 。 16 细胞基本知识 间期 G1期：DNA合成前期或细胞分裂后期。这一期细胞代谢比较活跃，RNA，蛋白质 合成旺盛，为S期的DNA合成做好准备，此期后阶段，中心体会进行分裂。这一 期从细胞生理变化上有一个矫正点（R点），由于各种内外因素的影响，它可能 控制G1期的延续时间变化，因此G1期的长短变化极大。 S期：DNA合成期，此期结束DNA会加倍。早期复制的DNA富有G-C碱基，晚期复制 的DNA富

10、有A-T碱基。此期DNA合成的同时，也有组蛋白的合成。 G2期：DNA合成后期，分裂前期。有活跃的RNA蛋白质合成，DNA含量已加倍，有 微管的合成，为M期纺锤丝微管组装提供原料。 17 M期 前期：此期的主要特征是染色质浓缩，确定分裂极，核仁解体，核膜消失。DNA 分子螺旋化和折叠，双螺旋缩短，形成染色单体，进而变成双结构，中间有着 丝粒相连。此时中心粒出现，周围有微管形成的星体，逐渐分离，到相对应位 置形成细胞两极。中心粒间的微管延长，形成纺锤体，染色体界于赤道部。 中期：进入中期的染色体高度浓缩，形成典型中期染色体，部分纺锤体开始附 着着丝粒上，染色体在赤道面上形成赤道板。 后期：染色体

11、开始一分为二，几乎所有的染色体同时分离，染色体被染色体丝 拉向两极，细胞也向两极方向延长呈椭圆形，最后在赤道部凹下形成哑铃状。 末期：染色体达到细胞两极，开始解螺旋，并形成染色质，核膜逐渐形成，核 仁出现，胞体逐渐分离，形成两个子细胞，两个子细胞进入G1期。 18 单抗基本知识 细胞基本知识 设备与器材准备、溶液配制 无菌技术 细胞培养 细胞计数 冻存、复苏 19 20 一、细胞常用设备和器材 二氧化塔摇床 超净工作台 设备与器材准备、溶液配制 21 倒置显微镜电动助吸器 程序降温盒 22 不锈钢柱式滤器 23 液氮罐细胞培养板 24 培养基储存瓶 细胞培养瓶 25 器材的清洗和灭菌 不要让污

12、染了的器皿变干！ 清洗的重要性 u 除化学污染：盐、油污、蛋白质、重金属等 u 使培养瓶内表面带负电荷，供细胞附着。 灭菌的重要性 u 除去微生物污染 酸液配方 26 新的玻璃器皿的清洗灭菌 u 自来水刷洗，除去灰尘。 u 烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5%稀盐酸中12小时以除去脏物、 铅、砷等物。 u 刷洗、烘干：泡酸12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲 洗干净后用烤箱烘干。 u 泡酸、清洗：用酸浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗10次， 最后蒸馏水冲洗3-5次。 u 烘干、包装：移液管和滴管的尾端要塞入棉花。 u 高压灭菌。 u 烘干备用。 27 使用后的

13、玻璃器皿的清洗灭菌 u 刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿立即用清水刷洗干净。 u 自来水浸泡过夜，泡酸前用自来水冲洗干净，烘干。 u 泡酸、清洗：烘干后泡入盐酸，12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲 洗10次（避免蛋白质干后粘附于玻璃上难以清洗），过蒸馏水3次。 u 烘干、包装 u 高压灭菌 u 烘干备用 28 金属器皿的清洗灭菌 u 金属器皿不能泡酸，清洗时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用 75%酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放 入铝制和内包装好。高压灭菌，再烘干备用。 橡胶和塑料器皿的清洗灭菌 u 刷洗、烘干：使用后立即用清水刷洗干净。 u 自来水浸

14、泡过夜，泡酸前用自来水冲洗干净烘干。 u 泡入5%盐酸过夜。 u 自来水冲洗10次，过蒸馏水3次。 u 烘干 u 高压蒸汽灭菌 u 烘干备用 u 滴管胶头可用75%酒精浸泡5分钟，紫外线照射消毒 29 二、细胞常用的培养液和试剂 培养用液是维持组织细胞生存、生长及进行细胞培养各项操作过程中所需的基 本溶液。 设备与器材准备、溶液配制 30 （1）平衡盐溶液（BSS） BSS又称生理盐水或盐溶液，主要由无机盐和葡萄糖组成。本身具有维持渗透压 ，调控酸、碱度平衡的作用，同时能共给细胞生存所需的能量和无机离子成分 ；用作洗涤组织、细胞及配制各种培养用液的基础溶液。 几种常用的平衡盐溶液： Ringe

15、r、PBS、Tyrode、Earle、Hanks、Dulbecco（都有相应配方） 最简单的BSS是Ringer。D-Hanks与Hanks的主要区别在于前者不含有Ca2+、 Mg2+，因此D-Hanks常用于配制胰酶溶液。 配制平衡盐溶液也应当用新鲜的三蒸水。配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高 温高压灭菌。有浑浊或沉淀时，应重新配制。 D-Hanks 31 （2）培养基 培养基就是人工模拟细胞在体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质， 他是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。 天然培养基 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好。 缺

16、点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。 易发生支原体污染。 合成培养基 根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低。 缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。 32 五大常用培养基 RPMI 1640 Dulbeccos Modified Eagles Medium（DMEM） Minimum Essential Medium（MEM） Iscoves Modified Dulbeccos Medium（IMDM） Medium 199 GBM05：21种氨基酸，8种无机盐，18种微量元素，12种维生素，11种其它营 养物组成。 33 34 （3）其它培养用液 u 消化液 胰酶溶液：浓度一般为0.1%-0.25%，配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血 清的平衡盐溶液。 u EDTA溶液：一种化学螯合剂，对细胞有一定离散作用，毒性小，使用方便， 浓度为0.02%。可与胰酶混合使用。