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1、厌氧菌的培养方法 n物理方法包括遮断空气法、煮沸法、真空法、空 气置换法、气体喷射法或转管法等 n化学方法包括焦性没食子酸法、铁丝绒法、保险 粉法等 n生物学方法包括与需氧菌共生好氧法、燕麦发芽 法等 n混合法包括厌氧罐（袋）法、厌氧手套箱法或厌 氧室法、空气置换铁丝绒法、空气置换钯粒法等 。 1 液体培养基的厌氧培养法 n培养基煮沸：驱气后置流水中急速冷却 n添加还原剂： 0.030.05L-盐酸半胱氨酸 0.010.02硫乙醇钠 0.51葡萄糖 0.1抗坏血酸 其它还原剂 n添加琼脂 2 固体培养基的厌氧培养法 n厌氧罐法 n简易厌氧罐和厌氧袋法 n钢丝绒法 n焦性没食子酸法 n抽气换气厌
2、氧培养法 n生物好氧厌氧培养法 n转管技术和气体喷射培养法 n厌氧手套箱法 （又称厌氧室法） 2.1 Gas-pak法 原理 气体发生袋： 柠檬酸和碳酸氢钠 H2O CO2 硼氢化钠 H2O H2 触媒 ： 钯粒 H2O 厌氧罐中的O2 厌氧指示剂 11111 厌氧指示剂 n亚甲基兰 指示剂 n卢卡斯固体厌氧指示剂 n布鲁氏指示剂 亚甲基兰 指示剂 n6葡萄糖水溶液 2 n0.1N氢氧化钠水溶液 0.1 n0.05亚甲基兰水溶液 0.2 厌氧 无色 残存有氧气 蓝色 卢卡斯固体厌氧指示剂 n2硼砂溶液 5毫升 n9硫乙醇酸 1毫升 n酚红溶液 0.10.2毫升 n0.02美兰溶液 10毫升 n
3、琼脂 1 厌氧 无色 残存有氧气 蓝色 布鲁氏指示剂 n60羟甲基氨基甲酯 1 n4葡萄糖 1 n0.02美蓝 1 厌氧 无色 残存有氧气 蓝色 Gas-Pak法的使用操作程序 n平皿培养基装入平皿架中置厌氧罐内； n打开内盖居中金属网袋，装入触媒钯粒； n打开锡箔纸袋，取出厌氧指示剂片； n剪开气体发生袋一角，注入10毫升水，迅速紧闭 罐盖，置培养箱中培养。 n约经510分钟后，放入厌氧指示剂片。 n注：操作较复杂，需注入水作为触媒。 2.2.1 简易厌氧罐 干燥器容内径（厘米） 容器1 容器2 容器3 容积（毫升） 硼氢钠 氯化钴 0.2克 柠檬酸0.6克 15cm（约2150毫升） 或
4、和 0.6克 钯粒1.5克 碳酸氢钠0.7克 18cm（约3500毫升） 硼氢钠 氯化钴0.33克 柠檬酸1克 或 和 1克 钯粒2克 碳酸氢钠1.15克 2.2.2 厌氧袋法 (三菱瓦斯化学株 式会社) 聚碳酸酯（复合塑料膜）制厌氧袋 n产气袋：2.5L、3.5L、350ml； n厌氧指示剂 n厌氧培养罐：2.5L、7L、15x30cm培养袋、立式 培养袋； n微需氧产气袋 适合嗜二氧化碳菌 培养 适合厌氧菌的培养 适合兼性厌氧菌 的培养 培 养 容 器 系 列 产 品 MGC厌氧培养产品信息列 表 n 耗材类产 品名称编号 AnaeroPack （安宁包） 厌氧产气袋C-1 微需氧产气袋C
5、-2 CO2产气袋C-3 Oxygen-Ind氧气指示剂C-22 AnaeroPouch （安宁包） 厌氧产气袋C-11 相应培养容器编号 2.5L密封盒C-31 7.0L密封盒C-32 立式培养袋C-43 通用 1530cm 培养袋 C-41 备注：少量样品培养选用AnaeroPouch系列产品（2-4皿/次）； 常规及大量培养选用AnaeroPack系列产品（10培养皿以上）。 厌氧培养气体变化曲线图 AnaeroPack-Anaero吸收容器中的氧气，产 生二氧化碳，30-60分钟内氧气被完全吸收 ，产生21%左右的二氧化碳。 微需氧培养气体变化曲线图 AnaeroPack-MicroA
6、ero吸收容器中的氧气， 产生二氧化碳，在一小时内氧气浓度变为8- 9%，二氧化碳浓度变为7-8%。 1.新鲜指示剂为粉红色（无氧，左）和蓝色（有氧 ，右），重复使用后受环境影响，反应减弱，指示 剂变为浅紫色（无氧，中左）和淡蓝色（有氧，中 右）。 2.厌氧培养2-3小时后指示剂颜色变化稳定。 氧气指示剂颜色变化图解 2.2.3 保险粉的厌氧罐培养法 n二亚硫酸钠（Na2S2O4） 碳酸氢钠 无水硫酸钠 n不用触媒 2.3 钢丝绒法 酸性硫酸铜溶液 钢(铁)丝绒 铜和铁的络合物 O2 厌氧指示剂 n酸性硫酸铜溶液： 将自来水1升加硫酸铜60g，吐温-80 20ml，加热溶解后，又加入2N的硫酸
7、90ml ，最后加水至6升 ； n方法： 取56g钢丝绒/ L，于11.5升酸性硫 酸铜溶液浸泡3060s，钢丝绒变成红铜色 ，挤净液体置铝质或玻璃容器中，放入厌 氧罐内。随后将厌氧指示剂放入，密封厌 氧罐，14h后可达厌氧状态 2.4 焦性没食子酸法 焦性末食子酸粉末， NaHCO3 或NaOH溶液 无菌玻片 已接种细菌的平板倒扣在上面 融化的白蜡封边 2.5 抽气换气厌氧培养法 n玻璃干燥罐 n混合气钢瓶: 10二氧化碳、10的氢气、80的氮气 n三通阀 n触媒:钯粒 / 浸泡钢丝绒 / 氯化钴 n厌氧指示剂 1：厌氧培养罐 2：混合气体（CO2：H2：N2=1：1：8）钢 瓶 3：压力表
8、 4：三通阀 5：缓冲瓶 6：真空泵 2.6 生物好氧厌氧培养法 n疱肉培养基: 牛肉渣 0.5g 牛肉浸液 7ml 液面上加盖34mm厚的融化凡士林，灭菌。 n生物好氧厌氧培养方法 2.7 转管技术和气体喷射培 养法 360 钢瓶进气 铜柱 除氧气体 （亮黄色） 微量O2 H2源 CuO （黑色） 接种或移植 2.8厌氧手套箱法 n又称厌氧室法 3 厌氧培养方法的选择 n亨格特的预还原灭菌厌氧培养基的转管技 术、气体喷射培养法 n厌氧手套箱培养法 用于要求严格的厌氧培养法的微生态学（正常菌群）的研 究工作 n厌氧罐(袋)法结合其它厌氧培养方法 适用于对氧极其敏感的厌氧菌。 在临床细菌的检验工
9、作中 ，可以充分使用此法分离感染症中的厌氧病原菌。 4 厌氧菌的保存 4.1继代保存： 以GAM半固体流动培养基和TEP半固 体培养基作传代培养保存。用毛细吸管吸 菌进行继代培养，使用白金接种环移菌接 种，可以避免有的菌在操作中接触空气或 氧化物而死亡。数周作一次继代培养。新 分离的的菌种，在几个月内，每34星期 传代一次。被保存的菌种，放室温下暗处 。最好是不同菌用不同培养基保存。 4.2 冷冻保存： 20脱脂牛奶0.5ml分注在带螺旋 塞的玻璃瓶中，经110、15分钟高压 灭菌，冷却后，先用毛细吸管取半固体 高层培养基2448h生长茂盛部位的厌 氧菌液0.5ml，加入玻璃瓶中，直接置 于80冰库中保存。 厌氧菌较理想的保存方法是液氮保 存法。将108以上浓菌液置脱纤维羊血 、脱纤维兔血或羊血牛奶各半的分散剂 中，先在干冰中预冻，然后连容器一起 放入液氮罐中。 谢谢 北京九和永泰科技有限公司/淮安九和生物科技有限公司 王龙 18912088019 0517-89338839
