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1、学会选择 懂得放弃 愿意奋斗 知道感恩 二代基因测序技术用于临床诊断 2011，临床研究性应用 无创产前基因检测 癌症及其他疾病风险的基因检测 神话般的“基因体检” 国内基因测序诊断产品无一经过 医疗器械审批注册 二、自本通知发布之日起，包括产前基因检测在内的所有医疗技术需 要应用的检测仪器、诊断试剂和相关医用软件等产品，如用于疾病的预 防、诊断、监护、治疗监测、健康状态评价和遗传性疾病的预测，需经 食品药品监管部门审批注册，并经卫生计生行政部门批准技术准入方可 应用。已经应用的，必须立即停止。 基因诊断 Gene Diagnosis 李文强 生物化学与分子生物学教研室 河南省生物精神病学重点
2、实验室 一.基因诊断的基本概念和特点 一.基因诊断的基本概念和特点 25%的生理缺陷、30%的儿童死亡都是由遗传病引起，基因与人类 健康的关系如此紧密，实现基因诊断成为现代医学必然需求 主要内容 1基因诊断的基本概念和特点 2基因诊断的内容和基本策略 3基因诊断的基本步骤 4基因诊断的常用技术方法 5基因诊断的应用及意义 一.基因诊断的基本概念和特点 生化诊断 免疫诊断 表型分析 临床诊断 一.基因诊断的基本概念和特点 DNA确定为遗传物质 1976年加州大学华裔科学家 简悦威用核酸分子杂交首次 对珠蛋白生成障碍性贫血进行诊断 人类基因组计划 人类单体型计划 千人基因组计划 疾病与基因的关系愈
3、加明晰，基因诊断进入快速发展期 一.基因诊断的基本概念和特点 狭义:在基因（DNA或RNA)水平，用PCR、核酸杂交 、基因重组、基因芯片等各种分子生物学技术检测特 定基因存在与否、结构变异和表达状态的过程，对疾 病作出诊断。 广义：应用于DNA指纹分析、个体识别、亲子鉴别等 司法鉴定，动植物检疫以及转基因动植物中阳性基因 的检测等方面。 一.基因诊断的基本概念和特点 目标疾病：与基因有关 内源性基因变异疾病（先天/后天） 单基因病 多基因病 获得性基因病 外源性基因（如病毒等）侵入机体引起的疾病 一.基因诊断的基本概念和特点 特点 针对性强：特定基因 特异性高：针对序列的定性定量 灵敏度高：
4、实现单分子诊断 稳定性高：遗传物质的稳定性，相对于表型 应用范围广：早期诊断，全程诊断 一.基因诊断的基本概念和特点 实现基因诊断的要素 疾病或个体表型的本质明确 遵循生物遗传学基本规律 分子生物学技术与方法可靠完备 二.基因诊断的基本策略和内容 基本策略 基因诊断策略 致病基因检测 连锁遗传标志检测 基因表达 定量分析 表型克隆 基因分析 二.基因诊断的基本策略和内容 基本内容 1.检测个体的基因序列的特征(多态性） 镰刀状红细胞贫血:珠蛋白基因的第六个密码子AT,表达产物 ：谷氨酸缬氨酸 2.基因突变分析（碱基插入，缺失，倒位等） 杜氏肌营养不良：DMD基因突变以缺失 二.基因诊断的基本策
5、略和内容 基本内容 3.基因表达产物分析 对mRNA进行分析（AFP） 4.检测是否存在外源基因 感染性疾病 5.基因连锁分析 存在遗传标记的疾病 三.基因诊断的基本步骤 1. 获得待检样品 2. 分离纯化DNA或RNA 3. 选择合适的技术手段 4. 基因检测分析 技术上已无任何障碍，继续向简便化、高通量、低成本努力 四.基因诊断的常用技术方法 1. 核酸分子杂交 2. PCR及相关技术 3. 核酸序列分析技术 4. 限制性酶谱分析技术 5. 基因芯片 核酸分子杂交和PCR是基因诊断的基本技术 四.基因诊断的常用技术方法 1. 核酸分子杂交 Southern blot Northern bl
6、ot Dot hybridization Reverse dot hybridization FISH: fluorescence in situ hybridization 四.基因诊断的常用技术方法 1. 核酸分子杂交 是指单链核酸分子（DNA或RNA）在特定条件下，与另一条 互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。 碱基互补： DNA与DNA杂交： A=T、 GC DNA与RNA杂交: A=U、 GC 变性：在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链； 复性：随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补双链 四.基因诊断的常用技术方法 1. 核酸分子杂交 利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，
7、可以用已知碱基序 列的单链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核酸互补配 对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在。 四.基因诊断的常用技术方法 Southern blot是早期基因诊断的主力 四.基因诊断的常用技术方法 FISH FISH荧光染色体原位杂交应用最为广泛 四.基因诊断的常用技术方法 点杂交Dot hybridization A C T T G G 探针杂交 NC膜探针 正常人突变纯合子 突变杂合子 突变型 野生型 2.PCR及相关技术 四.基因诊断的常用技术方法 2.PCR及相关技术 四.基因诊断的常用技术方法 正常人 患者 扩 增 电 泳 四.基因诊断的常用技术方法 3. 核酸
8、序列分析技术 正常对照 病例SOX9基因HMG box内发生单碱基置换突变 患儿 最直接、最确切的基因诊断方法 四.基因诊断的常用技术方法 4. 限制性酶谱分析技术 最经典的基因诊断方法 H M N 四.基因诊断的常用技术方法 5. 基因芯片 基因芯片技术是应用前景广阔的基因诊断技术 多基因多位点，基因表达分析，药物敏感分析 五.基因诊断的应用及意义 1. 遗传性疾病的基因诊断 2. 肿瘤的基因诊断 3. 传染病的基因诊断 4. 个体识别和物证分析 五.基因诊断的应用及意义 1. 遗传性疾病的基因诊断 辅助遗传病的临床诊断 单基因遗传病的基因诊断 ：已不存在任何技术障碍 产前诊断：高危人群，优
9、生优育 1.1k b 五.基因诊断的应用及意义 1.3kb 1.1k b 0.2kb 123 1、正常人 2、突变携带者 3、患者 1.1 kb 1.3kb 正常基因 突变基因 PCR-RE分析 MstII CCTGAGG-CCTGTGG 镰状红细胞贫血HBS-Beta株蛋白基因突变 五.基因诊断的应用及意义 1. 遗传性疾病的基因诊断 疾病易感性及患病风险预测 遗传病患病风险分析： 常见遗传病遗传筛查， 疾病易感性预测性诊断：疾病易感基因检测 在一些有明显遗传倾向的肿瘤中，这二类基因的突 变与肿瘤发生有密切关系 例： 视网膜母细胞瘤与RB基因 李-佛美尼症候群综合征与p53基因 乳腺癌与BR
10、CA-1基因 五.基因诊断的应用及意义 2. 肿瘤的基因诊断 检测异常表达基因：甲胎蛋白 检测肿瘤细胞基因变异：甲基化改变，序列改变 肿瘤易感基因变异：易感基因p53、p21 五.基因诊断的应用及意义 3. 传染病的基因诊断 检测病原体的遗传物质 检测病原体引起的基因表达 多采用荧光定量PCR HBV病毒 HIV病毒 SARS病毒 五.基因诊断的应用及意义 4. 个体识别和物证分析 嫌疑人生物材料的物证分析 亲缘关系 物 证12 3 4 五.基因诊断的应用及意义 意义 疾病诊断和风险预测的有力工具 是遗传病预防的基本支撑 可用于疗效评价和个体化用药指导 未来医学基本支撑点 是个体识别和法医学的
11、核心技术 存在的问题 技术上需要简便、可靠、低成本 理论上需要普及 降低专业依赖性临床化 基因治疗 Gene Therapy 李文强 生物化学与分子生物学教研室 河南省生物精神病学重点实验室 2012年11月3日，欧盟委员会批准了 西方世界首个基因治疗药物Glybera，标 志着修复基因缺陷的新颖医疗技术的一个 里程碑。该药用于治疗一种极其罕见的遗 传性疾病脂蛋白脂肪酶缺乏症。 预计每名患者的花费将高达125万欧 元（约合160万美元），该药将创造昂贵 现代医药的新纪录。 1990年，美国批准了第一例临床基因治疗申请。患者为四岁女孩 ，由于缺失腺苷脱氨酶（ADA)基因而患有严重综合性免疫缺陷
12、症。 腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的严重联合免疫缺陷(SCID) 病因: 淋巴细胞缺乏ADA 腺苷、dATP堆积 破坏免疫功能 患儿很少活到成年 n第一个基因临床治疗的方案(1990.9.14,NIH) n治疗策略： n淋巴细胞ADA酶 恢复至正常水平的 5%-10% 维持免疫系统功能 改善病人症状 Ashanti de Silva, Now 26 主要内容 1基因治疗的概念和特点 2基因治疗的基本策略 3基因治疗的基本方法 4基因治疗的应用 5基因治疗的意义及前景 1基因治疗的概念和特点 经典概念(狭义概念)： 将具有正常功能的基因置换或增补患者体内缺陷的 基因，从而达到治疗疾病的目的。 广义概
13、念： 将某些遗传物质转移至患者体内，使其在体内表达 ，或者在基因水平改变基因的表达，最终达到治 疗某种疾病的方法，均称之为基因治疗。 1基因治疗的概念和特点 拓展了传统医学的理论体系 从病因上解决部分疾病的治疗问题 为大量遗传病提供了治疗手段 能带动医学和生命科学的整体进展 2基因治疗的基本策略 1. 基因置换 2. 基因增补 3. 基因干预 4. “自杀基因” 5. 免疫基因治疗 6. 耐药基因治疗 2基因治疗的基本策略 1. 基因置换 2. 基因增补 3. 基因干预 4. “自杀基因” 5. 免疫基因治疗 6. 耐药基因治疗 2基因治疗的基本策略 1. 基因置换 定义：指将特定的目的基因导
14、入特定细胞，通过定位重组，以导入 的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。 目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。对缺陷基因的缺陷部位进 行精确的原位修复，不涉及基因组结构的任何改变。 2基因治疗的基本策略 1. 基因置换 要实现基因置换，需要采用同源重组技术使相应的正常基因定向导 入受体细胞的基因缺陷部位。 定向导入的发生率约1/100万，采用胚胎干细胞培养的方法，这种 同源重组的检出率最高可达1/10。 2基因治疗的基本策略 2. 基因增补 定义：通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。 类型： A:在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，补偿缺陷基因的功 能而细胞内的缺陷基因并未除去
15、； B:向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到 治疗疾病的目的。 2基因治疗的基本策略 2. 基因增补 目标位点 目的基因 基因载体 染色体 2基因治疗的基本策略 3. 基因干预 定义：采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基 因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。（区别于 抗生素的基因水平调节） 2基因治疗的基本策略 4. “自杀基因” 定义：自杀基因又称前体药物酶转化基因，这种基因导入受体细胞 后可产生一种酶，它可将原来无细胞毒性或低毒药物前体转化 为细胞毒性物质，将细胞本身杀死，这种基因被称为“自杀基 因”，可以通过整合位点等选择目标细胞。 2基因治
16、疗的基本策略 5. 免疫基因治疗 定义：通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以 增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。 6. 耐药基因治疗 定义：化疗过程中， 把产生抗药物毒性的基因导入患者体内，从 而使患者能耐受更大剂量的化疗。 3基因治疗的基本方法 1. 治疗性基因的获得 在了解疾病发生的分子机制基础上， 选择对疾病有治疗作用的特 定基因。 如，对单基因缺陷遗传病，可用野生型（非突变）基因即可用于治 疗； 对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因或抑癌基因 用于基因治疗。 治疗性基因的获得有赖对疾病病因和病理机制的深入研究 3基因治疗的基本方法 2. 基因载体的选择 基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能 调控其适度表达。 常用的载体有两类：病毒载体和非病毒载体。 病毒载体：逆转录病毒载体， 腺病毒载体， 腺相关病毒载体等； 非病毒载体：脂质体，受体介导等采用理化方法将治疗基因转移入
