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1、中山大学 博士学位论文 蛋白质直接电化学和去折叠及与小分子相互作用的研究 姓名：赵晓娟 申请学位级别：博士 专业：分析化学 指导教师：邹小勇 20090607 蛋白质直接电化学和去折叠及与小分子相互作用的研究 专业：分析化学 姓名：赵晓娟 导师：邹小勇教授 摘要 研究蛋白质的直接电子传递、蛋白质折叠去折叠的构象变化及其与小分子的相互作 用，可以获得蛋白质的热力学和动力学性质的重要信息，以及药物等小分子与蛋白质相结 合的动态信息，为构筑新型第三代电化学生物传感器提供了重要基础。本课题的研究有助 于理解和认识蛋白质的结构和功能之间的关系，对于蛋白质的定量检测和新药的开发也具 有重要意义。本论文共分
2、5 章，其主要内容分别如下： 1 综述了蛋白质的直接电化学、蛋白质的折叠去折叠、蛋白质与小分子化合物的相 互作用三方面的研究意义、方法和进展等。简述了本论文的选题意义和主要内容。 2 构建了新的蛋白质薄膜修饰电极体系，实现了辣根过氧化物酶( H I 冲) 的直接电化 学和生物催化作用。壳聚糖稳定的纳米金( A u C S ) 与片状剥落的粘土( C l a y ) 纳米片通过 静电相互作用进行杂化，制备得到粘土壳聚糖纳米金复合物( C l a y A u C S ) 。H R P 被固定 在C l a y A u C S 修饰的玻碳电极上，最后再覆盖一层粘土。紫外可见光谱( U V V i s
3、 ) 表明 H R P 在修饰膜里保持了它的天然构象。X 射线衍射( x I m ) 结果说明在修饰膜变干的过程 中，H R P 、A u C S 和C l a y 之间发生了一个相互穿插脱落重新堆叠的过程。在0 1Mp H 7 0 的磷酸缓冲溶液中，H R P 在- 0 1 9 5V 显示一对准可逆的氧化还原峰。该修饰电极用于检测 H 2 0 2 时电流响应快速，线性范围是3 9l x M 3 1m M ，检出限是9g M 。动力学参数，如电荷 转移系数、电子转移速率常数和米氏常数分别为O 5 3 、2 9 5 0 2 0s - 1 和2 3 1 5m M 。 3 实现了肌红蛋白( M b
4、) 在C l a y A u C S 修饰电极上的直接电化学和生物催化作用。 M b 被固定在C l a y A u C S 修饰的玻碳电极和外层的粘土保护层之间。使用电化学方法、 U V V i s 和X R D 对该修饰体系进行了表征。在该修饰体系里，M b 的X R D 结果与H R P 的 完全不同，说明蛋白质所带的净电荷能通过影响修饰膜中各层物质之间的相互作用，从而 使粘土的基面间距发生变化。通过对H 2 0 2 和N a N 0 2 的还原，考察了M b 在该修饰电极上 的生物催化活性。 4 建立了血红蛋白( H b ) 去折叠的模型。通过考察h e m eF e n l F e
5、的电化学响应，研究 了尿素和或p H 诱导H b 去折叠的构象变化。此外，使用光谱技术进一步进行表征。结果表 明，酸对H b 构象的影响明显大于碱和浓尿素：当使用尿素或者强碱变性时，H b 被去折叠但 h e m e 咪唑连接键没有断开；然而，当使用强酸( p H C D 远紫外C D ( 1 9 0 2 5 0n m ) 谱是蛋白质二级结构的灵敏探针【1 1 1 ，1 1 2 1 。C D 在近紫 外区( 2 5 0 3 5 0n m ) 和S o r e t 区( 3 5 0 4 5 0n m ) 谱图能反映蛋白质三级结构( 影响芳 香侧链和h e m e 的环境) 的变化。在远紫外区，蛋
6、白质结构中的仅螺旋在2 0 8 和2 2 2 i l l n 左右出现两个负槽；伊折叠给出2 1 5h a l 的负槽。利用该C D 谱可以推算蛋白质 分子的仅螺旋，伊折叠和伊转角以及无规卷曲的含量。C D 对蛋白质的构象变化非 常灵敏，当蛋白质变性时，常常发生a 螺旋和或肛折叠的减少或消失，以及无规 卷曲的增加，因此可以用C D 研究蛋白质的折叠去折叠。 ( 2 ) 荧光法 该法可分为两种：内源荧光和外源荧光。前者是测定蛋白质分子的自身荧光； 而后者是向蛋白质分子的特殊部位引入荧光探针，然后测定荧光探针的荧光。在蛋 白质中能发射荧光的氨基酸只有色氨酸( T r p ) 、酪氨酸( T y r
7、 ) 和苯丙氨酸( P h e ) 。 由于其侧链生色基团的不同，有不同的荧光光谱。 ( 3 ) U V - V i s 吸收光谱法 U V 二s 吸收谱的S o r e t 吸收带( 3 5 0 4 5 0n m ) 是由h e m e 与珠蛋白( g l o b i n ) 的 相互作用所引起的n 3 1 ，对于蛋白质h e m e 区的构象变化非常灵敏。蛋白质的紫外吸 收光谱主要是T r p 和T y r 残基的侧链基团对光的吸收，其次是苯丙氨酸( P h e ) 、组 氨酸( H i s ) 和半胱氨酸( C y s ) 残基侧链的吸收；此外还有肽键对光的强烈吸收。 在蛋白质中，各种生
8、色基团具有不同的微环境，微环境的性质是由蛋白质分子构象 所决定的。当蛋白质构象改变时，微环境随之改变，从而紫外吸收光谱发生改变。 ( 4 ) 拉曼光谱法 拉曼光谱是一种散射光谱，是分子的振动、转动光谱。可分为非共振拉曼光谱 第l 章绪论 和共振拉曼光谱。激光拉曼光谱能够显示蛋白质分子中肽键的特征振动谱带、主链 骨架的振动谱带，以及侧链的振动谱带。由于肽键的微环境是蛋白质主链构象的反 映，因此，可以利用肽键的特征性振动谱带作为指标，来推断蛋白质的主链构象。 ( 5 ) 电化学方法 蛋白质分子中有一些具有氧化还原性质的基团，如T y r 和X r p 等氨基酸、二硫 键、亚铁血红素中的铁等等，当蛋
9、白质变性后这些基团的电化学响应会发生变化。 分别比较蛋白质在天然态和不同变性程度时的循环伏安图( C V ) 和差示脉冲伏安 图( D P V ) ，就可以监测到蛋白质的构象变化，新氧化还原峰的出现往往预示着蛋 白质新物态的出现【1 1 4 1 。如果蛋白质折叠和去折叠态时活性位点的还原电势 a E 。r = 鄙一睇) 不同，那么折叠氧化态和还原态蛋白质的自由能将明显不同( 6 A G ；= A N 。傀一A G ；, R e d ) 1 1 5 1 。通过联合蛋白质去折叠前后的电化学数据和自由能变，可以 建立热力学循环，从而判断不同的蛋白质价态( 还原态和氧化态) 对于变性剂的稳 定性差异【
10、1 16 ，1 朋。 1 2 4 蛋白质折叠的主要模型 关于蛋白质的折叠机制，许多研究者作了深入而广泛的研究，建立了一些蛋白 质折叠的理论模型。主要包括以下几种： ( 1 ) 疏水坍塌模型( H y d r o p h o b i eC o l l a p s eM o d e l ) 【1 1 8 ，1 1 9 】 这种模型认为疏水相互作用是蛋白质折叠的决定性作用力。在折叠的起始阶 段，蛋白质的多肽链首先通过疏水作用力快速折叠形成“溶球体“ ( m o l t e ng l o b u l e ) ， 然后进一步地调整形成高级结构。 ( 2 ) 框架模型( F r a m e w o r k
11、M o d e l ) 1 1 2 0 框架模型的核心是二级结构的形成和稳定对于蛋白质的折叠起着决定性作用， 而且二级结构的形成独立于三级结构之间的相互作用。此模型认为蛋白质的折叠过 程分为几个阶段进行，依次为：二级结构单元的形成、二级结构框架的形成和蛋白 质三级结构的形成。 ( 3 ) 扩散碰撞模型( D i f f u s i o n C o l l i s i o nM o d e l ) 【1 2 1 ，1 2 2 1 该模型已被应用于解释蛋白质折叠动力学的许多特征。蛋白质的多肽链在折叠 时首先形成称为微结构域( m i c r o d o m a i n ) 的二级结构单元或者疏水簇
12、，然后这些局 1 6 中山大学博士学位论文蛋白质直接电化学和去折叠及与小分子相互作用的研究 部结构经过扩散、碰撞、粘附而形成较大的球状结构，最后再进一步折叠、调整形 成天然构象。 ( 4 ) 成核生长模型( N u c l e a t i o n G r o w t hM o d e l ) 【1 2 3 l 这种模型认为成核阶段是蛋白质折叠的限速步骤，核的形成依赖于一些在进化 中保守的氨基酸残基。蛋白质肽链上首先形成“折叠晶核“ ，然后其它部分以此为 核心继续折叠形成天然构象。 ( 5 ) 拼图模型( J i g s a w P u z z l eM o d e l ) 1 2 4 1 拼图
13、模型认为蛋白质的多肽链可以沿多种不同的途径进行折叠。蛋白质的各种 结构单元以不同方式折叠成拼图片断，最后这些片断再聚合形成天然构象。 1 3 蛋白质与小分子化合物相互作用的研究 蛋白质是生物体内具有重要生理功能的大分子，它与营养、发育、遗传和新陈 代谢等生命活动有着密切的联系，是药物发挥药效的重要载体和靶分子。许多小分 子化合物，如有机染料分子和药物分子等，能和蛋白质通过分子间作用力相结合而 形成超分子化合物。蛋白质和小分子化合物相互作用的研究，是生命科学、临床医 学和化学等学科研究的重要内容。该研究不仅对改进和发展蛋白质的定量测定方法 具有重要的促进作用，而且对于研究蛋白质和药物分子的相互作
14、用机制，促进新药 的开发具有重要意义。血清白蛋白是生物体内血液中含量最丰富的蛋白质，其分子 量相对较小，结构已基本明确，而且溶解性好、稳定性高、与许多小分子配体都具 有较好的亲和性，因此，血清白蛋白成为研究蛋白质与小分子化合物相互作用的理 想蛋白质。 1 3 1 血清白蛋白的结构与功能简介 血清白蛋白( S e r u mA l b u m i n ，S A ) 是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白，约 占血清总蛋白的6 0 ，浓度约为4 2gL 一。其结构简单，仅由一条单独的氨基酸多 肽链构成。血清白蛋白的二级结构单元主要为n 一螺旋结构，含量约为6 7 t 1 2 5 】。牛 血清白蛋白( B
15、 S A ) 和人血清白蛋白( H S A ) 具有达7 6 的高序列同源性【1 2 6 1 。H S A 的三维晶体结构研究表明其包含三个类似的结构域：I 、I I 、I I I ，每个结构域包含A 和B 两个亚区( s u b d o m a i n A 、B ) ，这些亚域结构分别命名为：I A 、I B 、I I A 、I I B 、 I I I A 和I I I B ，以槽口相对的方式形成圆筒状结构。这些亚域结构既具有一些共同的 1 7 第l 章绪论 特征，如疏水表面和碱性氨基酸簇等，也各自有其特性和不同的配体结合能力【1 2 5 ，1 2 7 ， 1 2 羽。脂肪酸和吲哚衍生物在三
16、个结构域均具有一定的结合能力，然而I 区还可以结 合脂环族化合物、一些染料和药物等，I I 区可以结合胆红素、染料和类固醇等，I I I 区则能与安定和其它一些药物相结合。其分子量约为6 6 0 0 0 ，等电点为p H 4 8 t 1 2 9 。 血清白蛋白是维持血液渗透压( 8 0 ) 的主要成分，从而保持机体细胞内环境 的稳定，在新陈代谢中起着重要作用；其在体内分解产生的氨基酸可参与氨基酸代 谢，用于组织蛋白的合成，参与维持体内蛋白质的动态平衡；因其具有较好的结合 能力，可与药物分子等相结合，也是血液中运输内源性和外源性物质的重要载体， 具有重要的生理意义【1 2 5 ，1 3 0 l 。 1 3 2 蛋白质与小分子化合物相互作用研究的意义 蛋白质是非常重要的生物功能分子，其定量检测是临床分析、生化分析和疾病 检测中的重要指标，其结构与功能的研究也是化学、生命科学和临床医学中非常活 跃的课题。蛋白质与小分子配体在适当的条件下通过非共价键结合形成一种超
