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1、华中科技大学 博士学位论文 血小板活化因子在脊髓水平的疼痛调控作用 姓名：马国平 申请学位级别：博士 专业：麻醉学 指导教师：田玉科 20090401 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 3 中文摘要中文摘要 血小板活化因子在脊髓水平的疼痛调控作用 血小板活化因子在脊髓水平的疼痛调控作用 博士研究生：马国平 研究生导师：田玉科 教 授 华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室 研究背景研究背景 组织损伤和炎症常引起慢性疼痛，表现为自发性疼痛、痛觉过敏和触觉异常性痛 敏。近十年来，对慢性疼痛的研究取得了较大的进展，痛觉传导通路的中
2、枢敏化被认 为是慢性疼痛产生和维持的重要原因。然而，中枢敏化的机制尚未完全阐明。研究表 明，在中枢敏化机制中，大量的内源性神经介质参与了痛觉信号的传导和调控。 血小板活化因子(platelet-activating factor, PAF)是免疫细胞和炎症细胞产生的一 种内源性磷脂，是一种强效的炎症介质。研究发现，PAF与中枢神经系统许多生理功 能和病理生理过程有关。神经细胞生成PAF，同时，神经细胞也是PAF的靶细胞，PAF 在神经信号传递中发挥重要作用。近几年有研究报道表明PAF可能参与神经中枢痛觉 信号的传导和调控，而PAF在痛觉信号传导和调控中的作用及相应机制仍有待进一步 研究。 前列
3、腺素类物质(prostaglandins, PGs)在炎性疼痛中的作用已得到广泛认可， 随着 研究的深入，PGs在其它类型疼痛如神经病理性疼痛中的作用也受到关注。目前的研 究认为，在慢性疼痛的产生及维持中，中枢及外周PGs均起作用。脊髓是调控痛觉信 号的重要中枢， 脊髓水平的PGs在疼痛的产生及维持中占有重要地位。 体外实验表明， PAF可诱导培养的大鼠星形胶质细胞释放前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)， 这一研 究提示PGE2及其限速酶环氧酶(cyclooxygenase, COX)可能参与神经中枢PAF调控痛 觉信号的机制，但目前尚无相关研究的报道。 华 中 科
4、技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 4 传统的观点认为，神经胶质细胞仅对神经元起着支持和营养作用，而没有细胞之 间的信号传递功能，因而认为从外周传入的痛觉信号在脊髓水平的调控和放大以及痛 敏状态的产生仅与神经元及其递质有关，而与神经胶质细胞无关。近些年，越来越多 的研究证据表明胶质细胞与疼痛调控有着密切关系，特别是在如炎症和神经损伤等病 理状态下。胶质细胞的激活及其促炎细胞因子的释放在病理状态下的痛觉过敏的产生 和疼痛持续状态中发挥重要作用。脊髓和胶质细胞大量表达PAF受体，PAF可激活体 外培养的胶质细胞，并诱导胶质细胞产生神经递质和促炎性细胞
5、因子。以上研究结果 提示，胶质细胞的激活及其促炎性细胞因子的释放可能参与神经中枢PAF调控痛觉信 号的机制，而目前尚无相关报道。 目前的研究认为，PAF通过与其受体相结合而发挥生物学效应，PAF有二类受体 结合位点，即低结合力的细胞膜表面结合位点和高结合力的细胞内位点。抑制PAF受 体可减轻大鼠炎性痛反应，而PAF受体拮抗剂用于其它疼痛模型如神经病理性疼痛的 研究尚未见报道。 为了进一步探讨PAF在痛觉信号调控中的作用及其机制，本课题进行了以下实验 研究：(1) 鞘内注射PAF对大鼠痛阈和脊髓环氧酶表达的影响，不同选择性环氧酶抑 制剂对鞘内注射PAF所致大鼠痛敏的抗伤害效应；(2) 鞘内注射P
6、AF对脊髓胶质细胞 活性和促炎性细胞因子表达的影响；(3) 鞘内注射PAF受体拮抗剂对SNI神经痛大鼠 镇痛作用的研究。 研究方法与结果研究方法与结果 1. 鞘内注射鞘内注射 PAF 对大鼠痛阈和脊髓环氧酶表达的影响对大鼠痛阈和脊髓环氧酶表达的影响 方法方法 雄性 Sprague-Dawley 大鼠 48 只随机分为 6 组，每组 8 只，鞘内置管：人工 脑脊液(artificial cerebral spinal fluid, ACSF)组，鞘内注射 ACSF 10 l；PAF 组，鞘内 注射 PAF 5 g；生理盐水(normal saline, NS)组，尾静脉注射 1.5 ml 生理盐
7、水，10 min 后鞘内注射 PAF 5 g；SC-560(环氧酶 1 选择性抑制剂，150 g/kg)组，NS-398(环氧 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 5 酶 2 选择性抑制剂，150 g/kg)组和吲哚美辛(低选择性环氧酶抑制剂，300 g/kg)组， SC-560、NS-398 和吲哚美辛分别溶解于 1.5 ml 生理盐水，尾静脉注射给药，10 min 后鞘内注射 PAF 5 g。 PAF 均溶解于 10 l ACSF。给药前测机械缩爪阈(PWMT)和 热缩爪潜伏期(PWTL)基础值，ACSF 组和 PAF 组鞘内给药
8、 15 min 后测 PWMT 和 PWTL 值，连续 5 h 每 15 min 测定一次；生理盐水组、SC-560 组、NS-398 组和吲哚 美辛组鞘内注射 PAF 30 min 后测 PWMT 和 PWTL 值。 各组大鼠痛阈测定结束后立即 处死， 取L4-6段脊髓组织， RT-PCR分析检测ACSF组和PAF组大鼠脊髓环氧酶COX-1、 COX-2 和 COX-3 mRNA 表达，放射免疫分析检测各组大鼠脊髓 PGE2含量。 结果结果 (1) 疼痛行为学观察：大鼠 PWMT 平均基础值为 39.751.85 g，PAF 组鞘 内注射 5 g PAF 迅速诱发大鼠触觉异常痛敏(tacti
9、le allodynia)，鞘内给药后各测痛时 间点 PWMT 值下降，与 ACSF 对照组比较差异有统计学意义(P0.05)，触觉异常痛 敏在 5 h 观察周期内持续存在，高峰期持续约 60 min；鞘内注射 PAF 诱发大鼠热痛敏 (thermal hyperalgesia)，大鼠 PWTL 平均基础值为 13.040.20 s，鞘内给药后各测痛时 间点 PWTL 值下降(P0.05)，热痛敏持续时间和高峰期与触觉异常痛敏一致。环氧酶 抑制剂 NS-398 和吲哚美辛减轻 PAF 诱发的触觉异常痛敏和热痛敏，与生理盐水对照 组相比，NS-398 组和吲哚美辛组 PWMT 和 PWTL 值升
10、高(P0.05)，而 SC-560 对机 械缩爪阈值和热缩爪潜伏期均无明显影响。(2) 脊髓 COX 表达 RT-PCR 分析：ACSF 组脊髓环氧酶COX-1、 COX-2和COX-3在转录水平均有表达， COX-1和COX-3 mRNA 表达水平低，COX-2 表达水平高(P0.05)；PAF 组鞘内注射 PAF 诱导 COX-2 表达增 强(P0.05)，而 COX-1 和 COX-3 表达水平未见明显改变。(3) 脊髓 PGE2放射免疫 分析： 与 ACSF 组比较， PAF 组鞘内注射 PAF 5 h 后脊髓组织 PGE2含量升高(P0.05)； 与生理盐水组比较，COX-2 选择性
11、抑制剂 NS-398 和非选择性环氧酶抑制剂吲哚美辛 均抑制 PAF 诱发的 PGE2升高(P0.05)，其中，NS-398 组 PGE2含量低于吲哚美辛组 (P0.05)，而 COX-1 选择性抑制剂 SC-560 组对 PAF 引起的 PGE2含量升高无明显影 响。 2. 鞘内注射鞘内注射 PAF 对脊髓胶质细胞活性和促炎性细胞因子表达的影响对脊髓胶质细胞活性和促炎性细胞因子表达的影响 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 6 方法方法 雄性Sprague-Dawley大鼠64只随机分为6组， 鞘内置管： 人工脑脊液(ACSF) 组
12、，16 只，鞘内注射 ACSF 10 l；PAF 组，16 只，鞘内注射 PAF 5 g；DMSO(二甲 基亚砜)组，8 只，腹腔注射 0.1% DMSO 生理盐水 2 ml，2 h 后鞘内注射 PAF 5 g； SC-514(10 mg/kg)组， SC-514(50 mg/kg)组和 SC-514(100 mg/kg)组， 每组 8 只， SC-514 分别溶解于 2 ml 0.1% DMSO 生理盐水，腹腔注射给药，2 h 后鞘内注射 PAF 5 g。 PAF 均溶解于 10 l ACSF。给药前测 PWMT 和 PWTL 基础值，鞘内给药后 5 min、 15 min、30 min、4
13、5 min 、60 min 、90min 和 120min 各时间点测 PWMT 和 PWTL 值。各组大鼠痛阈测定结束后立即处死，取 L4-6段脊髓组织，免疫组织化学染色检测 ACSF 组和 PAF 组大鼠腰段脊髓 GFAP 和 OX-42 的表达，ELISA 检测各组大鼠脊髓 TNF- 和 IL-1 的表达。 结果 结果 (1) 疼痛行为学观察：PAF 组鞘内注射给药迅速诱发大鼠触觉异常痛敏和 热痛敏， 各测痛时间点PWMT和PWTL值均下降(P0.05)。 IKK选择性抑制剂SC-514 预处理明显减轻 PAF 诱发的触觉异常痛敏和热痛敏，其作用呈剂量依赖性增强，与 DMSO 对照组比较
14、， SC-514 不同剂量组各测痛时间点 PWMT 和 PWTL 值均升高 (P0.05)。(2) 胶质细胞活性免疫组织化学分析：PAF 组鞘内注射 PAF 激活星形胶质 细胞和小胶质细胞，大鼠脊髓灰质区可见分别以 GFAP 和 OX-42 标记的活化星形胶 质细胞和小胶质细胞，活化评分达(+)，对照组活化评分为()；各组脊髓灰质背角 GFAP 和 OX-42 免疫阳性反应物的光密度值分析，PAF 组高于 ACSF 对照组，差异有 统计学意义(P0.05)。活化的胶质细胞分布于整个脊髓灰质，在脊髓背角中主要分布 在第 层。(3) 促炎性细胞因子 TNF- 和 IL-1 表达 ELISA 分析：
15、与 ACSF 组比 较，PAF 组鞘内注射 PAF 2 h 后脊髓促炎性细胞因子 TNF- 和 IL-1 表达均增强 (P0.05)，IKK 选择性抑制剂 SC-514 预处理明显抑制 PAF 诱导的 TNF- 和 IL-1 的表达增强(P0.05)，其抑制作用呈剂量依赖性。 3. 鞘内注射鞘内注射 PAF 受体拮抗剂对受体拮抗剂对 SNI 神经痛大鼠镇痛作用的研究神经痛大鼠镇痛作用的研究 方法方法 雄性 Sprague-Dawley 大鼠 64 只，随机分为 6 组：SNI 组，16 只，制作 SNI 疼痛模型；假手术组(sham 组)，16 只；DMSO(二甲基亚砜)组，8 只，制作 SN
16、I 疼 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 7 痛模型， 鞘内注射 0.1% DMSO 生理盐水 5 l； BN52021(100 g)组， BN50730(100 g) 组和 BN52021(100 g)+BN50730(100 g)组，每组各 8 只，制作 SNI 疼痛模型，鞘内 注射给药，PAF 受体拮抗剂 BN52021 和 BN50730 溶解于 5 l 0.1% DMSO 生理盐水。 DMSO 组和拮抗剂治疗组每天鞘内注射给药一次，连续给药 7 d。第 7 d 测各组大鼠 PWMT 值，随后处死大鼠取 L4-6段脊髓，免疫组织化学染色检测各组大鼠脊髓 c-fos 表达，放射免疫分析检测 sham 组和 SNI 组大鼠脊髓 PAF 含量。 结果结果 (1) 疼痛行为学观察：SNI组神经损伤诱发大鼠触觉异常痛敏，术后第7 d PWMT值下降，与假手术组比较，差异有统计学意义(P0.05)；鞘内注射PAF受体拮 抗剂BN52021和BN50730
