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1、生物样品分析方法的建立和确证药物非临床药代动力学研究技术指导原则（第二稿）2013年4月GuidanceforIndustryBioanalyticalValidation，FDA2001GuidelineonbioanalyticalvalidationEMA21July2011孟志云野战输血研究所血液药理学研究室院药物代谢动力学重点实验室010-66931993mengzhiyun11.简介2.体内药物分析方法设计与建立3.方法学确证内容21.1生物样品分析是药代研究的必备手段分析化学是化学科学中的“眼睛”透过“窗户”获得大量的信息定量分析定性分析（半定量）1.简介31.2方法学类型及特点
2、：体内药物分析方法大致可归为：1.色谱法：吸附、分配、分子筛、离子交换、亲和等，HPLC-UV，HPLC-MS41.2方法学类型及特点：2.免疫分析法：ELISA，enzyme-linkedimmunosorbentassayEIA，enzymeimmunoassayRIA，radioimmunoassay51.2方法学类型及特点3.同位素:1H14C125I125I131IGammacounter氧化燃烧炉14C3H液体闪烁仪14C3H6体内药物分析方法特点灵敏度高：浓度低受到给药剂量的限制受到生物利用度的限制专一性好：生物内源性物质的干扰体内新形成的代谢产物干扰样品量少：血液（血浆、血清、
3、全血）尿、胆汁、唾液、汗液、脑脊液粪便、组织器官7方法快捷：不是专门的方法学研究，利用方法较快的阐明药理学的问题。可靠、重现性好：药代实验的不可重复性。药物类型多：需要多种仪器、技术手段的配套81.2.1光谱分析法比色法紫外分光光度法荧光分光光度法1.2.2色谱法分离效率高专一性较高HPLC:适用范围广室温检测样品预处理简单流动相选择范围广仪器自动化程度高GC:化合物气化；载气种类少；方法灵敏，但受到进样量的限制TLC:灵敏度低，现较少使用91.2.3毛细管电泳法分离效率高专一性较高毛细管区带电泳胶束电动毛细管色谱毛细管凝胶电泳毛细管等电聚焦毛细管等速电泳毛细管电色谱法进样量少，检测条件受限制
4、。101.2.5同位素法:灵敏度高专一性差放射强度表示标记药物量(eq.ngml)同位素技术与其他分析法相结合以提高专一性1.2.4免疫分析法:放射免疫分析酶免疫分析荧光免疫分析11122.体内药物分析方法设计与建立2.1体内药物分析方法设计的主要依据2.1.1明确分析方法设计的目的要求a.临床药物监护简便、快速、批量测定b.药代动力学研究是否要求原形药物与代谢物同时测定注意整个浓度变化的范围样品量多方法尽可能简便13c.配合新药设计合成、药理、毒理学的研究药物是否吸收生物利用度如何T12TmaxCmax化合物药代的快速评价要求方法学简单，快捷的提供实验数据。d.新药报批参照CFDA颁布的指导
5、原则按照SOP进行试验.较快的获得信息142.1.2了解待测药物的特性调研文献药物的结构、理化性质检测方法溶解度稳定性药物的药理和毒理作用机制生物样品:动物属性组织器官体内代谢情况药物的剂量给药途径干扰成分的多少样品的预处理方法152.1.3仪器设备与实验室条件文献资料的可参考性可重复性别人可做的事情是否适合我们实验室硬件建设是否与研究课题相互匹配162.2体内药物分析方法设计与建立的一般步骤根据被测药物的性质药物浓度的大致范围(经验估计)仪器设备条件对药物和研究目的的理解程度灵敏专一简捷可行初步分析方法的预试优化确证生物样品测定的关键是方法学的确证（Validation）。方法学确证是整个药
6、代动力学研究的基础。所有药代动力学研究结果，都依赖于生物样品的测定，只有可靠的方法才能得出可靠的结果。通过准确度、精密度、特异性、灵敏度、重现性、稳定性等研究对建立的方法进行确证。制备随行标准曲线并对质控样品进行测定，以确保检测方法的可靠性。生物样品测定的关键是方法学的确证（Validation）。方法学确证是整个药代动力学研究的基础。所有药代动力学研究结果，都依赖于生物样品的测定，只有可靠的方法才能得出可靠的结果。通过准确度、精密度、特异性、灵敏度、重现性、稳定性等研究对建立的方法进行确证。制备随行标准曲线并对质控样品进行测定，以确保检测方法的可靠性。173生物样品分析方法的确证183生物样
7、品分析方法的确证分析方法确证分为全面确证和部分确证两种情况全面方法确证：首次建立的生物样品分析方法、新的药物或新增代谢物定量分析部分方法确证：如生物样品分析方法在试验室间的转移、定量浓度范围改变、生物基质改变、稀少生物基质、证实复方给药后分析方法的特异性等19生物样品分析方法的全确证特异性标准曲线和定量范围精密度和准确度定量下限稳定性提取回收率微生物学和免疫学分析20CFDA21FDA22EMA23基本概念准确度：在确定的分析条件下，测得值与真实值的接近程度。精密度：在确定的分析条件下，相同基质中相同浓度样品的一系列测量值的分散程度。特异性：分析方法测量和区分共存组分中分析物的能力。这些共存组
8、分可能包括代谢物、杂质、分解产物、基质组分等。24基本概念灵敏度：生物样品分析方法的灵敏度主要通过测定定量下限样品的准确度和精密度来表征。重现性：不同试验室间测定结果的分散程度，以及相同条件下分析方法在间隔一段短时间后测定结果的分散程度。稳定性：一种分析物在确定条件下，一定时间内在给定基质中的化学稳定性。25基本概念标准曲线：试验响应值与分析物浓度间的关系。应采用适当的加权和统计检验，用简单的数学模型来最适当地描述。标准曲线应是连续的和可重现的，应以回归计算结果的百分偏差最小为基础。提取回收率：分析过程的提取效率，以样品提取和处理过程前后分析物含量百分比表示。26基本概念定量范围：包括定量上限
9、（ULOQ）和定量下限（LLOQ）的浓度范围，在此范围内采用浓度-响应关系能进行可靠的、可重复的定量，其准确度和精密度可以接受。生物基质：一种生物来源物质，能够以可重复的方式采集和处理。例如全血、血浆、血清、尿、粪、各种组织等。基质效应：由于样品中存在干扰物质，对响应造成的直接或间接的影响。27基本概念分析批：包括待测样品、适当数目的标准样品和质控样品的完整系列。一天内可以完成几个分析批，一个分析批也可以持续几天完成。标准样品：在生物基质中加入已知量分析物配制的样品，用于建立标准曲线，计算质控样品和未知样品中分析物浓度。质控样品：即QC样品，系指在生物基质中加入已知量分析物配制的样品，用于监测
10、生物分析方法的重复性和评价每一分析批中未知样品分析结果的完整性和正确性。28(1)特异性至少要考察6个不同个体空白生物样品色谱图空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度）用药后的生物样品色谱图对于以软电离质谱为基础的检测方法（LC-MS、LC-MSMS等），应考察基质效应293031323334(2)标准曲线和定量范围标准曲线高低浓度范围为定量范围，在定量范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。至少5个非零浓度建立标准曲线，使用与待测样品相同的生物基质不允许将定量范围外推求算未知样品的浓度建立标准曲线时应随行空白生物样品，但计算时不包括该点353637图1典型标准曲线38(3)精密度
11、和准确度3个浓度，低浓度在定量下限的3倍或3倍以内，高浓度接近于标准曲线的上限，中间选一个浓度每一浓度每批至少测定5个样品，至少3个分析批精密度用质控样品的批内和批间相对标准差（RSD）表示，相对标准差一般应小于15%，在定量下限附近相对标准差应小于20%准确度一般应在85%115%范围内，在定量下限附近应在80%120%范围内394041(4)定量下限定量下限是标准曲线上的最低浓度点至少能满足测定35个半衰期时样品中的药物浓度，或Cmax的110120时的药物浓度准确度应在真实浓度的80%120%范围内，RSD应小于20%，由至少5个标准样品测试结果证明4243(5)稳定性含药生物样品在室温
12、、冰冻或冻融条件下以及不同存放时间的稳定性储备液的稳定性样品处理后的溶液中分析物的稳定性44454647484950(6)提取回收率考察高、中、低3个浓度的提取回收率结果应精密和可重现51基质效应(matrixeffect)52基质效应和提取回收率MatrixEffect=BCExtractionEfficiency=AB53提取回收率54基质效应55稀释效应5657携带效应（Carryoveruation）在方法评价中，线性的最高浓度（如1000ngml）被测试之后，必须测试试剂空白样品来评价Carryover。在样品出峰的时间（RT）试剂空白样品可能会出现一个相应的信号，这个信号是LLOQ
13、的百分之几（LLOQ%）LLOQ:1.0ngmlAcceptance:0.8-1.2ngml(1.0ngml的20%)在进样高浓度样品时，在分析系统中会产生“携带污染”；“污染”到什么程度时，分析方法可以接受；什么程度时，分析方法不可以接受58Carryover可允许接受的范围“20%ofLLOQ”如果：方法学的LLOQ=1ngml那么：X0.2ngml59假定：在validation试验中，观察到1000ngml（线性范围的最高浓度）样品引起50%ofCarryover(残留量)，指的是LLOQ的50%(1ngml的50%=0.5ngml)“cut-off”浓度(残留量在20%的LLOQ以下
14、的药物浓度)：1000ngml0.5ngml=X0.2ngmlX=400ngml60携带效应实验61未知样品再分析IncurredSamplesReanalysis(ISR)62IncurredSamplesReanalysis(ISR)63部分确证64656667微生物学和免疫学分析标准曲线本质上是非线性的，所以尽可能采用比化学分析更多的浓度点来建立标准曲线如果重复测定能够改善准确度，则应在方法确证和未知样品测定中采用同样的步骤68生物样品分析方法的应用1.在生物样品分析方法确证完成之后开始测试未知样品。2.推荐由独立的人员配制不同浓度的标准样品对分析方法进行考核。3.每个未知样品一般测定一
15、次，必要时可进行复测。来自同一个体的生物样品最好在同一分析批中测定。4.每个分析批应建立标准曲线（组织分布试验时，可视具体情况而定），随行测定高、中、低3个浓度的质控样品，每个浓度至少双样本，并应均匀分布在未知样品测试顺序中69生物样品分析方法的应用5.质控样品数大于未知样品总数的5%。6.质控样品测定结果的偏差一般应小于15%，最多允许13质控样品的结果超限，但不能在同一浓度中出现。7.浓度高于定量上限的样品，应采用相应的空白基质稀释后重新测定。8.对于浓度低于定量下限的样品，在进行药代动力学分析时，在达到Cmax以前取样的样品应以零值计算，在达到Cmax以后取样的样品应以无法定量（Notd
16、etectableND）计算，以减小零值对AUC计算的影响。70分析方法的应用717273新版说明生物样品分析方法仍然以附录形式存在，鉴于与临床的通用性，建议在适当的时间单独制定指导原则。结合中国药典2015版的修订情况对部分内容进行了更新，使二者保持一致。74REFERENCES1.http:www.fda.govcderguidanceindex.htmGuidanceforIndustryBioanalyticalValidationFDA20012.药药物非临临床药药代动动力学研究技术术指导导原则则（第二稿），2013年4月3.Apresentationofprof.HUPEI2012-124.“某创创新药药物非临临床药药代动动力学研究总结报总结报告”，九所七室内部资资料75
