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1、8/5/2024 1第四章第四章 食品中细菌及其大肠菌群的检测食品中细菌及其大肠菌群的检测食品中细菌菌落总数的测定食品中大肠菌群的测定8/5/2024 2第一节食品中菌落总数的测定第一节食品中菌落总数的测定8/5/2024 3一、一、菌落总数菌落总数GB/T 4789.2-2010: :食食品品检检样样经经过过处处理理，在在一一定定条条件件下下培培养养后后，所所得得每每mlml（或或每每g g）检检样样中中形成的微生物菌落总数。形成的微生物菌落总数。本标准规定的培养条件下所得结果，只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。 8/5/2024 4二、菌落总数测定的意
2、义二、菌落总数测定的意义1 1、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。2 2、预测食品存用的期限长短。、预测食品存用的期限长短。3 3、了解细菌在食品中的繁殖动态。、了解细菌在食品中的繁殖动态。8/5/2024 5三、菌落总数测定的方法三、菌落总数测定的方法 平板倾注法平板倾注法 平板表面涂布法平板表面涂布法8/5/2024 6四、平板倾注法测定菌落总数四、平板倾注法测定菌落总数检验步骤检验步骤(程序程序)： 检样检样稀释处理稀释处理做平板做平板培养培养菌落计数菌落计数报告结果报告结果8/5/2024 7（一）、样品稀释及做平板（一）、样品稀释及做平板1ml1
3、ml1ml1ml1:101:10001:1001:100001ml1ml1ml加入营养琼脂加入营养琼脂1520ml25g样品样品生理盐生理盐水水8/5/2024 8 注意：注意：检样从开始稀释到倾注最检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过后一个平皿所用时间不宜超过20min。 8/5/2024 9对照对照空白对照：空白对照：不加样品，反映培养基中的不加样品，反映培养基中的杂质及污染情况杂质及污染情况稀释液对照稀释液对照：加：加1mL无菌稀释液，反映无菌稀释液，反映稀释液是否受到污染稀释液是否受到污染无菌操作对照：无菌操作对照：在空气中暴露在空气中暴露30min，反，反映空气质量和操作
4、技术映空气质量和操作技术8/5/2024 10（二）培养（二）培养普通食品普通食品: 37 48h ， 倒置放平板倒置放平板水产品水产品: : 30 48h8/5/2024 11（三）计数和报告（三）计数和报告 到达规定培养时间，应立即到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将计数。如果不能立即计数，应将平板放置于平板放置于0 044，但不得超过，但不得超过24h24h。8/5/2024 121、菌落的选择、菌落的选择（1 1）单个菌做一个菌落计）单个菌做一个菌落计（2 2）呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，）呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作为一个菌落计，如存在有几条不同来源
5、的作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算。链，则每条链均应按一个菌落计算。（3 3）如片状菌落不到平板一半，而另一半又）如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2 2代代表全平板的菌落数。表全平板的菌落数。8/5/2024 132、平板菌落计数的选择、平板菌落计数的选择 选取菌落数在选取菌落数在30300之间的平板之间的平板。（1 1）、）、若只有一个稀释度平板上的菌落数若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内：在适宜计数范围内： 计算两个平板菌落数的平均值，再将平计算两个平板菌落数的平均值，再将
6、平均值乘以相应的稀释倍数，做为每克（毫均值乘以相应的稀释倍数，做为每克（毫升）的菌落总数结果。升）的菌落总数结果。8/5/2024 142、平板菌落计数的选择、平板菌落计数的选择2）若有两个连续稀释度的平板菌落在适宜范围：）若有两个连续稀释度的平板菌落在适宜范围： N=C/(n1+0.1n2)d 式中，式中， N 样品中菌落数样品中菌落数 C平板菌落数之和平板菌落数之和 n1第一个适宜稀释度第一个适宜稀释度平板数平板数 n2第二个适宜稀释度第二个适宜稀释度平板数平板数 d稀释因子（第一稀释度）稀释因子（第一稀释度）8/5/2024 15稀释度稀释度1：100（第一稀释度）（第一稀释度）1：10
7、00（第二稀释度）（第二稀释度）菌落数菌落数232，24433，35 例：例： N=C/(n1+0.1n2)d （2322443335）/2+(0.12) 10-2 544/2.2 10-2 24772=250008/5/2024 16 3 3）如均大于）如均大于300300，则取最高稀释度的平均菌，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告落数乘以稀释倍数报告 4 4）如均小于）如均小于3030，则以最低稀释度的平均菌落，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告数乘稀释倍数报告 5 5）如菌落数有的大于）如菌落数有的大于300300，有的又小于，有的又小于3030，不在不在303030030
8、0之间，以最接近之间，以最接近300300或或3030的平均菌的平均菌落数乘以稀释倍数报告落数乘以稀释倍数报告 6 6）如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于）如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1 1乘以最低稀释倍数报告。乘以最低稀释倍数报告。 8/5/2024 178/5/2024 183、菌落数的报告1 1）菌落数在）菌落数在1100时，按实际数字报告；时，按实际数字报告；2 2）如大于或等于）如大于或等于100时，则报告前面两位有效数字，时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入第三位数按四舍五入计算；计算；3 3）所有平板蔓延菌落无法计数，报告菌落蔓延；）所有平板蔓延菌落无法计数，
9、报告菌落蔓延；4 4）所有空白对照菌落生长，则检测结果无效；）所有空白对照菌落生长，则检测结果无效；5 5）固体检样以克（）固体检样以克（g)为单位报告，为单位报告，6 6）液体检样以毫升（）液体检样以毫升（ml）为单位报告，）为单位报告，7 7）表面涂擦则以平方厘米（）表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。）报告。 8/5/2024 19五、菌落总数五、菌落总数Petrifilm测试片法测试片法8/5/2024 20复习题1、什么是菌落总数菌落总数？2、测定食品、饮料等产品的菌落总菌落总数有什么意义？3、画出平板倾注法测定菌落总数的示意图。平板倾注法测定菌落总数的示意图。4、在测定菌落总数时，
10、如何、在测定菌落总数时，如何选择菌落进行计数？5、在菌落总数菌落总数的检验中，要注意哪些事项？6、在菌落总数菌落总数的检验中，如何根据样品的特性选择培养温度和时间？8/5/2024 21第二节第二节 食品中大肠菌群的检验食品中大肠菌群的检验8/5/202422一、大肠菌群一、大肠菌群 1、 什么是大肠菌群？什么是大肠菌群？在一定条件下在一定条件下（3636条件下培养条件下培养48h48h）能发酵乳糖、能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。菌。（GB/T 4789.3-2010GB/T 4789.3-2010）2 2、大肠菌群的组成大
11、肠菌群的组成: : 大肠埃希氏菌发属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯大肠埃希氏菌发属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。氏菌属和阴沟肠杆菌。8/5/2024 23属代表种致病性埃希氏菌属 （Escherichia） 大肠埃希氏菌 (E.coli) 肠道外感染， 急性腹泻 志贺氏菌属 （Shigella） 痢疾志贺氏菌 (Sh.dysenteriae) 细菌性痢疾爱德华氏菌属 （Edwardsiella） 迟纯爱德华氏菌 (E.tarda) 蛇类等血动物的正常肠道寄居菌，偶见于健康人或腹泻者粪便内沙门氏菌属 （Salmonella） 伤寒沙门氏菌 (S.typhi) 肠热症、急性肠炎、败血症
12、枸橼酸杆菌属 (Citrobacter) 弗劳地氏枸橼酸杆菌 (C.freundii) 条件致病菌，引起继发性感染克雷伯氏菌属 (Klebsiella) 肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae) 肺炎，泌尿系、创伤感染 败血症等 阴沟肠杆菌(Enterobacter) 产气杆菌 (E.aerogenes) 很少引起原发性感染哈夫尼亚菌属 (Hafnia) 蜂窝啥夫尼亚菌 (H.alvei) 对人无致病性沙雷氏菌属 (Serrati) 粘质沙雷氏菌 (S.marcescens) 条件致病菌，引起泌尿系， 呼吸道及创伤感染 变形杆菌属 (Proteus) 普通变形杆菌 (P.vulgaris)
13、食物中毒，泌尿系、呼吸道感染 等耶尔森氏菌属 (Yersinia) 鼠疫耶尔森氏菌 (Y.pestis) 鼠疫欧文氏菌属 (Erwinia) 草原居民欧文氏菌 (E.herbicola) 植物寄生菌，曾从人体肠道及化脓扁桃体中分离到8/5/2024 241 1、粪便污染的指标菌：、粪便污染的指标菌： 大肠菌群大肠菌群二、二、大肠菌群的测定意义大肠菌群的测定意义8/5/2024 252、以大肠菌群作为粪便指标菌原因、以大肠菌群作为粪便指标菌原因1)在粪便中数量最大；在粪便中数量最大；2)在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；3)检测方法简便容易。检测方法简便
14、容易。8/5/2024 263、大肠菌群的测定意义大肠菌群的测定意义（1）判断食品中否受到）判断食品中否受到粪便污染。粪便污染。（2）有利于控制肠道传染病的发生和流行。有利于控制肠道传染病的发生和流行。（3）有利于控制食品在生产加工、运输、保有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。存等过程中的卫生状况。8/5/2024 27三、三、大肠菌群的生物学特性大肠菌群的生物学特性1.1.形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。2.发酵乳糖产酸产气发酵乳糖产酸产气 3.培养特性：培养特性： 8/5/2024 28EMB平板照片平板照片在琼脂上的典在
15、琼脂上的典型菌落型菌落:呈深紫黑色或中心深呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；常有金属光泽；8/5/2024 29麦康凯琼脂平板麦康凯琼脂平板Age of culture is 24 h在麦康凯琼在麦康凯琼脂上的典型脂上的典型菌落菌落:呈桃红色或呈桃红色或中心桃红、中心桃红、圆形，扁平，圆形，扁平，光滑湿润。光滑湿润。8/5/2024 30、大肠菌群数量的表示方法、大肠菌群数量的表示方法1）大肠菌群大肠菌群MPN大肠菌群MPN是采用一定的方法，应用统计学的原理所测定和计算出的一种最近似数值； 2）大肠菌群菌落数）大肠菌
16、群菌落数3）大肠菌群值大肠菌群值大肠菌群值是指在食品中检出一个大肠菌群细菌时所需要的最少样品量。故大肠菌群值越大，表示食品中所含的大肠菌群细菌的数量越少，食品的卫生质量也就越好：在这两种表示方法中，目前国内外普遍采用大肠菌群MPN，而大肠菌群值逐渐趋于不用。8/5/2024 31四、四、大肠菌群大肠菌群检验方法及操作方法检验方法及操作方法大肠菌群大肠菌群MPNMPN的检验方法：的检验方法：8/5/2024 32检样检样稀释处理稀释处理BGLG肉汤肉汤产气产气大肠菌群阴性大肠菌群阴性不产气不产气接种接种LST肉汤管肉汤管不产气不产气产气产气大肠菌群阳性大肠菌群阳性查表查表报告结果报告结果8/5/
17、2024331:1001:10各加入1ml各加入1ml各加入1ml发发酵管酵管发发酵管酵管发酵发酵管管初发酵检样稀释检样量1g/ml检样量0.1g/ml检样量0.01g/ml证实试验发酵管发酵管查MPN表报告结果8/5/2024 34MPN法简介法简介The Most Probable Number Method8/5/2024351g/ml检样中最近似值检样中最近似值(MPN)表表以1、0.1、0.01、各用3管。阳性管数MPN个个/100 g/ml1g/ml30.1g/ml30.01g/ml30003000130002600039001030011600129001312002060021
18、90022120023150030900311300321600331908/5/2024 36大肠菌群平板计数法8/5/2024 37平板菌落数的选择选取菌落数在15 CFU150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。8/5/2024 38证实试验从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36 1 培养24 h48 h，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。8/5/2024 39大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群
19、阳性的试管比例比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g（mL）=6.0105 CFU/g（mL）。8/5/2024 40六、六、大肠菌群快速检验大肠菌群快速检验食品大肠菌群快速检验方法：食品大肠菌群快速检验方法：TTC显色法显色法DC试管法试管法纸片法纸片法8/5/2024 41( (三三)DC()DC(去氧胆酸钠去氧胆酸钠) )半固体试管法半固体试管法选选择择三三个个稀稀释释度
20、度的的样样品品液液，每每个个稀稀释释度度分分别别取取1ml1ml放放入入灭灭菌菌试试管管中中。将将溶溶化化并并冷冷至至5050左左右右的的DCDC半半固固体体培培养养基基加加入入上上述述试试管管中中，每每管管3m13m1。立立即即混混合合，凝凝固固后后于于3737培培养养18182424小时。小时。判定标准和记录：判定标准和记录： a a 培养基变桔红色，有气泡产生或琼脂崩裂。培养基变桔红色，有气泡产生或琼脂崩裂。 b b 培培养养基基为为桔桔红红色色，或或有有桔桔红红色色菌菌落落，无无气气泡泡和和琼琼脂脂崩崩裂现象；裂现象； c c 培养基为绿色，有黄色菌落，无气泡和琼脂崩裂现象；培养基为绿
21、色，有黄色菌落，无气泡和琼脂崩裂现象； d d 培养基为绿色。培养基为绿色。判判定定为为a a、d d反反应应结结果果；记记录录阳阳性性管管数数，查查MPNMPN表表并并报报告告之之。若若为为b b、c c反反应应结结果果，可可挑挑大大肠肠菌菌群群可可疑疑菌菌落落接接种种乳乳糖糖复复发发酵管，根据产酸产气管数查酵管，根据产酸产气管数查MPNMPN表，并报告之。表，并报告之。8/5/2024 42（一）食品饮料大肠菌群快速检验纸片（一）食品饮料大肠菌群快速检验纸片使用方法：1.1.样品稀释同国标法样品稀释同国标法2.2.接种：接种： 饮料和饮用水采用原液、饮料和饮用水采用原液、1:101:10、
22、 1:1001:100三个稀三个稀释度，固体食品采用释度，固体食品采用1:1 1:1 、1:101:10和和1:1001:100三个稀三个稀释度。用释度。用1 1亳升灭菌吸管吸取亳升灭菌吸管吸取1 1亳升同一稀释度亳升同一稀释度的稀释液均匀涂布到袋中的纸片上，做三个重的稀释液均匀涂布到袋中的纸片上，做三个重复。复。8/5/2024 433.3.培养：培养：将接种好的纸片轻轻压平（可叠放），在将接种好的纸片轻轻压平（可叠放），在3636下培养下培养151524h24h观察结果。观察结果。4.4.结果判定结果判定: :1)1)纸片上出现紫红色斑点纸片上出现紫红色斑点, ,其周围有黄圈者其周围有黄圈
23、者, ,为阳性为阳性. .2)2)纸片为一种着色纸片为一种着色, ,无菌落生长者为阴性无菌落生长者为阴性. .3)3)纸片呈紫兰色纸片呈紫兰色, ,有紫红色斑点，其周围地黄圈者有紫红色斑点，其周围地黄圈者阴性阴性. .4)4)酸性食品接种后酸性食品接种后, ,纸片变黄纸片变黄, ,经培养后无紫红色斑经培养后无紫红色斑点为阴性点为阴性8/5/2024 44（二）餐具大肠菌群快速检验（二）餐具大肠菌群快速检验(纸片法纸片法)使使 用用 方方 法法 ：1.1. 采样采样6 61010份。份。碗、盘、杯等每份贴纸片两张碗、盘、杯等每份贴纸片两张，用无菌生理盐水湿用无菌生理盐水湿润纸片后，立即贴于食具内
24、侧表面，润纸片后，立即贴于食具内侧表面，3030秒后取下，秒后取下，置于原塑料袋内。筷子以置于原塑料袋内。筷子以5 5只为一份样品，用吸管只为一份样品，用吸管吸取生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端（约吸取生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端（约5cm5cm）抹拭两张，放入原塑料袋内）抹拭两张，放入原塑料袋内。8/5/2024 452.2.将已采样的纸样置于将已采样的纸样置于3737C C培养培养1515小时小时. .纸片在黄色背景上出现红色斑点为阳性，纸片在紫纸片在黄色背景上出现红色斑点为阳性，纸片在紫兰色背景上呈现红色斑点，但周围没有黄晕均为兰色背景上呈现红色斑点，但周围没有黄晕均为大肠菌
25、群阴性。同一份样品两张纸片均是阴性为大肠菌群阴性。同一份样品两张纸片均是阴性为合格。合格。8/5/2024 46食品冷饮大肠菌群检验纸片冷饮、乳制品和调味品等大肠菌群的测定8/5/2024 47食品食品饮料大料大肠菌群快速菌群快速检验纸片片饮料、食用料、食用纯水和糕点的大水和糕点的大肠菌群菌群测定定8/5/2024 48餐具大肠菌快速检验纸片餐具卫生消毒效果检测8/5/2024 49（三）（三）petrifilm试纸片试纸片8/5/2024 50LST肉汤管肉汤管胰蛋白胨胰蛋白胨氯化钠氯化钠乳糖乳糖磷酸氢二钾磷酸氢二钾磷酸二氢钾磷酸二氢钾月桂基磺酸钠月桂基磺酸钠蒸馏水蒸馏水大肠菌群的产气量，多者可以使发大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管。可以用手轻轻打动试管。8/5/2024 51BGLG肉汤肉汤蛋白胨蛋白胨乳糖乳糖牛胆粉溶液牛胆粉溶液.煌绿水溶液煌绿水溶液蒸馏水蒸馏水8/5/2024 52复习题1、什么是大肠菌群？大肠菌群由哪些微生物组成？2、测定食品、饮料等产品的大肠菌群数有什么意义？3、大肠菌群具有哪些生物学特性？4、在大肠菌群数的检验中，要注意哪些事项？
