褪黑素对丙烯酰胺所致神经细胞氧化损伤保护作用的研究

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1、华中科技大学 硕士学位论文 褪黑素对丙烯酰胺所致神经细胞氧化损伤保护作用的研究 姓名：陆慧萍 申请学位级别：硕士 专业：卫生毒理学 指导教师：严红 20090501 3 褪黑素对丙烯酰胺所致褪黑素对丙烯酰胺所致褪黑素对丙烯酰胺所致褪黑素对丙烯酰胺所致神经细胞氧化损伤保护作用神经细胞氧化损伤保护作用神经细胞氧化损伤保护作用神经细胞氧化损伤保护作用的的的的研究研究研究研究 硕士研究生：陆慧萍 导师：严红 副教授 摘摘摘摘要要要要 丙稀酰胺（ ACR）是一种用途广泛的化工原料，可应用于废水处理，化妆品制造 ， 染料合成以及在实验室中的大分子电泳分离中。 除了职业暴露， ACR 也在香烟和高温 加工的

2、薯类和谷物类食品中存在，例如炸薯条，饼干和面包。 ACR 在人体和实验动物 中都已证明它的神经毒性，慢性的、低剂量的职业人群暴露会产生如共济失调，肌 无 力，和手足麻木感。实验动物每天暴露于 ACR 会产生与人群相似的渐进性的神经症 状，如共济失调和骨骼肌无力。目前 ACR 的神经毒性机制并未有确切的定论，有研 究认为氧化损伤是其导致神经损伤的可能机制之一，且维生素 C 和维生素 E 可以减 轻 ACR 引起的毒性。 研究发现褪黑素可以保护缺血再灌注，炎症，离子辐射和缺氧等病理改变。此外 ， 褪黑素是一个高效的自由基清除剂，并具有广谱的抗氧化作用。褪黑素因其极好的 亲 脂性和亲水性，可以轻易通

3、过体内各种生理屏障，如血脑屏障等。因此，褪黑素可 在 机体任何部位发挥其潜在的抗氧化作用。 本试验在 ACR 导致 PC12 细胞氧化损伤的基础上，研究 MT 对 ACR 所致氧化 损伤的保护作用，以及对MT 的可能的作用机制进行探讨，为防治丙烯酰胺中毒提供 科学依据。 4 第一部分：第一部分：第一部分：第一部分： MTMTMTMT 对对对对ACRACRACRACR 所致所致所致所致PC12PC12PC12PC12 细胞毒性的保护作用细胞毒性的保护作用细胞毒性的保护作用细胞毒性的保护作用 目的：目的： 探讨MT 对ACR 引起的PC12 细胞毒性的保护作用。 方法：方法： 设7 个组，分别为空

4、白对照组，溶剂对照组（0.1%无水乙醇） ，MT 组， Luzindole 组，ACR 组，ACR+MT 组，ACR+MT+Luzindole 组，后三组中ACR 剂 量分别为1.25、2.5、5、10、20、40 mmol/L，MT 终浓度为50 mol/L，Luzindole 终 浓度为0.2 mol/L（MT 和Luzindole 用无水乙醇助溶，无水乙醇含量为总体积的0.1 ） ，处理24 h 后以MTT 法测定细胞存活率。 结果：结果： ACR 组 2.5、5、10、20、40 mmol/L 的细胞生长率分别为 89.04%、70.02%、 55.05%、44.34%、22.46%

5、显著低于对照组，1.25 mmol/L 细胞生长率为 93.31%，与 对照组差异无统计学意义。ACR 组的细胞 24 h IC50为 15.35 mmol/L。经过浓度为50 mol/L 的 MT 预处理，1.25、2.5、5、10、20 mmol/LACR 染毒计量的细胞存活率均 比相应 ACR 单独处理的细胞存活率高， 分别为 157.84%、123.83%、109.36%、85.69%、 57.98%， 加入 MT 后 24 h IC50升高为 22.39 mmol/L。 以浓度为 0.2 mol/L 的 ML1 受 体阻断剂 Luzindole 阻断后，1.25、2.5、5、10 m

6、mol/LACR 染毒的细胞存活率仍高于 单纯 ACR 染毒组，但较MT 保护组低，具体数据分别为125.80%、116.16%、94.53%、 62.37%，20、40mmol/LACR 染毒的细胞存活率较 MT 保护组低，与单纯ACR 染毒 组相近，为 40.17%、17.76%，其 24 h IC50为 14.37mmol/L。 结论：结论： 一定浓度的 ACR 能抑制 PC12 细胞的生长，MT 对 ACR 导致的细胞毒性作 用具有较好的保护作用，阻断 MT 受体 ML1 后，其保护作用基本消失。 5 第二部分：第二部分：第二部分：第二部分： MTMTMTMT 对对对对ACRACRAC

7、RACR 所致所致所致所致PC12PC12PC12PC12 细胞氧化物质生成的清除作用细胞氧化物质生成的清除作用细胞氧化物质生成的清除作用细胞氧化物质生成的清除作用 一、一、一、一、MTMTMTMT 对对对对 ACRACRACRACR 诱导的诱导的诱导的诱导的 P P P PC12C12C12C12 细胞细胞细胞细胞 ROSROSROSROS 生成的清除作用生成的清除作用生成的清除作用生成的清除作用 目的：目的： 观察 MT 对 ACR 诱导的 PC12 细胞 ROS 生成的清除作用。 方法：方法：（1）观察 ACR 对 ROS 影响的时间-剂量-效应关系。根据处理时间分为 5 个 时间点（1

8、 h，3 h，6 h，12 h，24 h），每时间点三个浓度组（1.25 mmol/L，2.5 mmol/L，5 mmol/L），并设置一个空白对照组。 （2）使用1.25 mmol/L 和2.5 mmol/L 的ACR 剂量染毒6 h，试验分为空白对 照组, ACR 组， ACR+MT组（ 50 mol/L MT 提前 24 h，同时，推后3 h干预） ， ACR+MT+Luzindole 组（50 mol/L MT 和0.2 mol/L Luzindole 提前24 h，同时，推 后3 h共同处理）。 结果：结果：（1）ACR 组5 mmol/L ACR染毒1 h，3 h 较对照组ROS

9、水平有所升高，但24 h 的ROS 水平下降，结合细胞存活率结果，认为因染毒剂量高，细胞有死亡现象或细 胞功能被抑制，出现活性氧水平下降。 2.5 mmol/L ACR染毒1 h，6 h ROS 水平高于对 照组；1.25 mmol/L ACR 染毒在6 h 和12 h 时间点 ROS 较对照组水平高。 （2）提前 24 h MT 干预 1.25 mmol/L ACR 染毒 6 h 的细胞 ROS 水平明显低 于 ACR 染毒组，以 Luzinddole 阻断 ML1 受体后与 MT 干预组无显著差别；MT 同 时干预 ACR，ROS 水平下降明显，以 Luzinddole 阻断后，ROS 水

10、平上升显著高于 MT 干预组；MT 推后 3 h 干预，发现并未能使 ACR 染毒后 ROS 水平降低。 提前 24 h MT 干预 2.5 mmol/L ACR染毒6 h 的细胞ROS 水平明显低于 单纯 ACR 染毒组，以 Luzinddole 阻断 ML1 受体后，ROS 水平又上升明显高于 MT 干预组；MT 同时干预，ROS 水平下降更明显，以Luzinddole 阻断后，ROS 水平上 升明显高于 MT 干预组；MT 推后 3 h 干预，并未能使 ACR 染毒后的 ROS 水平降 低。 结论：结论：（1）ACR 对PC12 细胞内ROS 水平的影响与其染毒剂量和染毒时间均有关， 6

11、 剂量高ROS 水平在短时间内就有所升高，剂量低ROS 水平上升则需要作用一定的时 间。 （2）提前 24 h 和同时 MT 干预，可使 ACR 所致的细胞内 ROS 水平升高有所 改善，起到保护作用。受体阻断剂对同时干预的 MT 有显著的阻断作用，对提前24 h MT 干预 2.5 mmol/L ACR 染毒组也有阻断作用，但对提前24 h 干预 1.25 mmol/L ACR 染毒组无明显的阻断作用。 二二二二、MTMTMTMT 对对对对 ACRACRACRACR 诱导诱导诱导诱导 P P P PC12C12C12C12 细胞细胞细胞细胞 MDAMDAMDAMDA 生成的清除作用生成的清除

12、作用生成的清除作用生成的清除作用 目的：目的： 观察 MT 对 ACR 引起的 PC12 细胞 MDA 生成的清除作用。 方法：方法：（1）观察 ACR 对 MDA 影响的时间-剂量-效应关系.根据处理时间分为 5 个 时间点（1 h，3 h，6 h，12 h，24 h），每时间点三个浓度组（1.25 mmol/L，2.5 mmol/L，5 mmol/L），并设置一个空白对照组。 （2）使用5 mmol/L ACR 染毒6 h，试验分为空白对照组, ACR组，ACR+MT 组 （50 mol/L MT 提前24 h，同时，推后3 h干预） ，ACR+MT+Luzindole组（50 mol/L

13、 MT 和0.2 mol/L Luzindole 提前24 h，同时，推后3 h共同处理） 。 结果：结果：（1）ACR 单独处理细胞，只有高浓度5 mmol/L ACR 染毒 3 h，6 h，12 h，24 h 组和对照组有显著差异，其他组与对照组相比均无显著性差异。 （2）提前 24 h MT 干预后 MDA 含量降低，明显低于对照组和 ACR 单独处 理组，当加入 Luzindole 后，MDA 含量升高，与单纯 ACR 染毒无差异。MT 同时 和推后 3 h 干预，细胞内 MDA 含量无明显改变。 结论：结论：（1）较高剂量的 ACR（5 mmol/L）可使细胞中的 MDA 含量增加。

14、 （2）提前以 MT 干预，对 ACR 引起的细胞内 MDA 含量的增加有所清除作 用，Luzindole 可阻断 MT 的作用。 7 第三部分：第三部分：第三部分：第三部分：MTMTMTMT 对对对对ACRACRACRACR 降低降低降低降低PC12PC12PC12PC12 细胞细胞细胞细胞SODSODSODSOD 含量含量含量含量 的保护作用机制初探的保护作用机制初探的保护作用机制初探的保护作用机制初探 一、一、一、一、MTMTMTMT 对对对对ACRACRACRACR 降低降低降低降低PC12PC12PC12PC12 细胞细胞细胞细胞SODSODSODSOD 含量含量含量含量的保护作用的

15、保护作用的保护作用的保护作用 目的：目的： 观察 MT 对 ACR 降低 PC12 细胞 SOD 含量的保护作用。 方法：方法：（1）试验分为 4 组，一个对照组，和三个 ACR 处理组，ACR 处理组浓度分 别为 1.25 mmol/L，2.5 mmol/L，5 mmol/L，染毒 6 h。 （2）使用5 mmol/L ACR 染毒6 h，试验分为空白对照组,ACR组，ACR+MT 组 （50 mol/L MT 提前24 h，同时，推后3 h干预） ， 。 结果：结果：（1）以 1.25，2.5，5 mmol/LACR 分别处理 6 h 后，发现 5 mmol/LACR 组的 细胞 SOD

16、相对含量明显低于对照组。其他两组的 SOD 含量与空白对照组无明显差 异。 （2）MT 提前干预 24 h 后，细胞内 SOD 水平上升，明显比 ACR 单独处理 组高，与空白对照组无统计学差异，但是 MT 同时与推后 3 h 干预，SOD 含量仍明显 比对照组低。 结论：结论： （1）较高剂量的 ACR（5 mmol/L）对细胞中的 SOD 含量有影响。 （2）说明 MT 在提前作用的情况下对 ACR 导致的细胞内 SOD 含量降低有 保护作用。 二、二、二、二、MTMTMTMT 对对对对ACRACRACRACR 降低降低降低降低PC12PC12PC12PC12 细胞细胞细胞细胞SODSODSODSOD 含量含量含量含量的保护作用机制研究的保护作用机制研究的保护作用机制研究的保护作用机制研究 目的：目的： 对MT 保护ACR 引起PC12 细胞SOD 含量降低的作用机制进行初步的研究。 方法：方法： 将细胞分为 6 个处理组，分别为对照组， ACR组，ACR+MT 组(50 mol/L MT 提前 24 h 干预，ACR 染毒 6 h)，ACR+MT+