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1、葡萄糖浓度对体外培养胰岛的分泌功能的影响 吕秀菊丛 威 傅德贤 欧阳藩 ( 中科院过程工程研究所生化工程国家重点实验室， 北京3 5 3 信箱，1 0 0 0 8 0 ) 摘要本文 在体外培养的原代小民肤岛水平详细考察了 培养基中荀萄 特浓度对于 波岛素分泌水平和旋 岛 对荀萄 村的 利嗽响 应 教感 性指数 ( S tim u la te d R e s p o n s e In d e z , S R I )的形响，明 确在2 2 . 2 . M荀萄 林浓 度环境培养4 8 h r 造成肤岛素分泌水平和S R I 位的不可逆损伤，建立了在高葡萄枯浓度下映岛功能顿伤 模型。 关性词枪尿病从岛
2、蔺萄粉功能报伤模型 前盲 搪尿病、癌症和心血管疾病是目前世界上爆发率最高的慢性病。随着经济的发展， 糖尿病 患者呈现日 益增多的趋势，全世界目 前有搪尿病病人约1 . 3 亿， 这个数目 预计到2 0 5 0 年将达到3 亿 W。 我国 近 年来， 随 着人民 生活水 平的 提高， 饮食结构和生活方 式的改 变， 糖尿病患者数目 显 著); 升。糖尿病患者中有8 5 %以上均为II 型糖尿病。II 型糖尿病发病是与胰岛素抵抗和胰岛素 分泌 缺陷密切相关的。目 前比 较普遍的 观点认为高 血糖是加重 胰岛 素分泌 缺陷的直 接原因 f2 ， 长 期高血糖环境促进了 胰岛细胞的功能衰竭， 临床表现
3、出高血糖和胰岛素分泌水平下降的典型糖 尿病症状。 细胞培养是现代病理研究和化合物药效筛选的有力手段。细胞培养具有成本低、周期短的 特点，能够在生命结构的基本单位细胞水平反应生理、生化特性，在细胞水平实验获得的 结果对于临床有直接的指导意义。本文以体外培养的原代小鼠胰岛为手段，详细考察了培养基 中葡萄 搪浓度对于 胰岛素分泌水平和胰岛对葡萄搪的刺激响应敏感性指数 ( S t i m u l a t e d R e s p o n s e I n d e x , S R I )的影响， 建立了在高葡萄搪浓度下胰岛功能损伤模型。 1 实脸材料和方法 1 ) 昆明种小鼠: 北京大学医学部实验动物中心
4、2 ) 胎牛血清:天津市川页生化制品有限公司 3 ) R P M I 一 1 6 4 0 培养基: G i b c o C o ， 补充1 0 0 1 U / m l 的青霉素和1 0 0 m g / m l 的硫酸链霉素和1 0 % ( v / v )的胎牛血清。 4 ) 葡萄糖:分析纯，北京化学试剂二厂 5 ) 9 6 孔塑料培养板:N U N C L O N B r a n d P r o d u c t s ( D e n m a r k ) 6 ) P o l y 一 L 一 l y s i n e : 北京经科试剂公司， S i g m 。 进口 分装 7 ) 小鼠 胰岛 分离 和
5、纯 化: 参考文献 l 3 8 ) 胰岛 素检 测: 放射免疫分析l4 1 9 ) 胰岛素放免分析检测试剂盒:原子能科学院同位素研究所 1 0 ) p 计数器: F f 一 6 3 0 G 型， 北京核仪器厂 1 1 ) S R I 值测定: 胰岛依次在2 7 . 8 m M葡萄糖浓度和3 . 3 m M葡萄糖浓度分别培养2 h r ， 所测得 相应胰岛素含量的比 值为S R I 值。 2 实验结果与讨论 2 . 1 体外长期培养时葡萄枪浓度对于肤岛素分泌水平和S R I 值的影响 按照世界卫生组织规定I s J ， 正常人空腹血糖浓度范围在7 . O m M以下，当任意时刻检测血糖 浓度高于
6、 1 1 . 1 m m时即可确诊为糖尿病。实验中考察了葡萄糖浓度在5 , 5 一 2 7 . 8 m M的范围内，体 7 4 5 外培养胰岛的胰岛素分泌水平， 和培养第1 , 3 , 5 天时胰岛对于葡萄糖刺激的响应值 ( S R I ) 。实 验结果如图1 和图2 所示。为了排除由干胰岛个体差异和接种时每孔中胰岛数目不同造成的影 响，卖 验中胰岛素水平均采用相对值来表达。即实验开始时检测在同一葡萄糖浓度下培养一定 时间各孔内胰岛素水平。并将此绝对值作为该孔的胰岛素水平基准，以后各实验条件下，检测 得到的胰岛素水平与基准值比较所得到的比值代表该实验条件下的胰岛素分泌水平。 一 - F 5 .
7、 5 mM - 1 1 “ mm 050505050505 655443322刁.10 一所 0000 64内0 今内一岛卜今8 a604a加00806040200 一佗仍男七岁ul芍巴1 B a s a l 1 2 4 6 8 1 0 d a y s a ft e r i n o c u l a t io n d a y s a ft e r i n o c u la t i o n 圈t 不同有蔺稼浓度下胶岛班分泌速率变化。以 s . 5 m m葡萄稼浓度培养2 4 h r 的跳岛寮分泌水平为 甚准。以后每旧2 4 h r 换全部培养苍， 并恤测相应麟 岛索含. 圈z 不同翻萄翻浓度培养
8、l . 3 、5 天后的腆岛 有萄橄刺滋响应指傲 ( S R I 】变化 由图可以看出，体外培养胰岛的胰岛素分泌水平及分泌稳定性与葡萄糖浓度密切相关。在 低糖浓度范围，胰岛能够维持相对长时间的分泌稳定性，分泌功能的衰减随时间变化不明显， 而在高糖浓度环境培养的胰岛功能衰减随糖浓度的提高而变得越来越迅速。具体是，在5 . 5 m M 和1 1 . I . M的葡萄糖浓度培养的胰岛， 胰岛素分泌水平在实验考察的1 0 天范围内没有明显的功 能衰减;在1 6 . 7 m M葡萄糖浓度中培养的胰岛，在培养到第 6天之后，胰岛素分泌水平出现下 降; 在2 2 . 2 m M和2 7 . 8 m M葡萄糖
9、环境中培养的胰岛， 在接受刺激的第1 天，出现胰岛素分泌水 平的迅速上升，但从第2 天开始，就无法再维持相应的胰岛素分泌响应，而是出现随培养时间延 长明显的功能衰减。上述现象证明了胰岛分泌功能的稳定性严重受到培养环境葡萄糖浓度的影 响，高葡萄糖浓度导致体外培养的胰岛的分泌功能迅速衰减。 除腆岛素分泌水平外， S R I 值与培养环境葡萄糖浓度也密切相关。由图2 可以看出在同一葡 萄糖浓度下，随培养时间延长S R I 值逐渐降低，即胰岛对葡萄塘刺激响应的敏感性逐渐下降;在 同样培养时间条件下，葡萄糖浓度越高S R I 值越低， 说明体外培养的胰岛在高糖刺激下，容易失 去对葡萄搪的刺激响应敏感性，
10、即S m值的下降与葡萄糖浓度呈正相关。上述现象证明高葡萄糖 浓度对胰岛所造成的损伤，不仅表现为胰岛素分泌水平的逐渐衰减，也体现为胰岛对葡萄搪刺 激的敏感性下降。 2 . 2 短期葡萄糖作用下的肤岛素分泌及分泌响应指数 为了 进一步明确在短时间范围内，胰岛对葡萄糖刺激的变化情况，实验考察了在接种后 7 2 h r 之内5 . 5 m M和2 2 . 2 m M葡萄糖培养环境下， 胰岛的激素分泌水平累积变化曲线和S R I 值变 化， 结果见图3 和图4 0 由图3 可以看出，在低糖环境培养的胰岛7 2 h r 之内可以维持稳定的胰岛素分泌水平，表现 为培养基中胰岛素累积含量随培养时间延长呈线性渐
11、进增长;而在高糖环境中培养的胰岛，在 培养的最初4 8 h r 之内，胰岛素累积水平基本也维持与时间相关的线性增长， 但在4 8 小时以后， 胰岛素分泌水平则出现较为明显的下降。由图4 可以看出，S R I 值在低糖环境维持稳定，即低糖 环境培养的胰岛可以保持对外界葡萄糖刺激良 好的响应性;而在高糖环境培养的胰岛， S R I 值随 7 4 6 高糖刺激时间的延长呈现逐渐下降的趋势。 述数据表明高糖浓度在短时间内可以刺激胰岛素 分泌水平迅速上升，但同时造成胰岛的激素分泌疲劳，导致随培养时间延长，胰岛接受葡萄糖 刺激的敏感性逐渐下降，而且胰岛素分泌疲劳现象在胰岛接受高糖刺激的初期就表现出来。 0
12、5习5习5D5习 544332211 -比的 一5 . 5 mM 一。 - 2 2 . 2 mM一王 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 ho u r s 2 6 1 2 2 4 4 8 7 2 45403530要20朽相50 劝招q七.山七目u一一n巴1 h o u r s 图3 低/ 离稼浓度下，体外连续培养 7 2 h r 的胰岛 素积累水平变化。以5 . 5 m m葡萄赚浓度培养 2 h r 的 跳岛索水平为鑫准 图4 低/ 离摘浓度下，体外连续培养7 2 h r 的肢岛 的刺激响应指数 ( S R I )变化 2 . 3 高糖刺激后低糖恢复实验的胰岛素
13、分泌及葡萄糖刺激响应水平 高糖环境下胰岛功能衰减在进人低糖环境时能否恢复是衡量胰岛功能永久损伤与否的重要 判断标准。实验中将在2 2 . 2 m M葡萄糖浓度培养0 - 7 2 h ; 的胰岛马上 转入5 . 5 . M葡萄糖环境继续 培养6 h r ，检测低糖培养6 h : 之内的胰岛素含量和6 h r 低糖刺激之后的S R I 值，结果如表I 所示。 裹1 高偏刺激后恢复低箱培养的胶岛幸分泌水平及S R I 值 Cu l t u r e c o n d i t i o n s I n s u l i n ( t im e s o f b a s a l ) S R I C o n t ro
14、l ( w it h h i g h g l u c o s e o n l y ) h G O h r + I G 6 h r 3 . 0 2 t 0 . 1 4 h G l 2 h r + I G 6 h r 2 . 9 5 t 0 . 3 7 h G 2 4 h r + 1 6 6 h r 2 . 8 6 t 0 . 4 9 h G 4 8 h r + I G 6 h r 2 . 0 5 t 0 . 2 9 h G 7 2 h r + I G 6 h r 1 . 8 1 t O. l 6 . . . .网 h G 二 h ig h g lu c o s e ( 2 2 . 2 m M )
15、 ; I G 二 lo w g lu c o s e ( 5 . 5 m M ) 4 . 5 1 z 0 . 3 6 3 . 6 5士0 . 4 7 3 . 1 0士0. 1 4 2 . 1 1 士0 . 2 2 1 . 6 5士0. 2 7 3 . 1 7 t 0 . 1 9 2 . 6 9士0 . 2 5 2 . 0 3 t 0 . 1 7 1 . 7 0 t 0. 2 0 山该表可以看出，高搪培养4 8 h r 的胰岛在恢复低搪培养时， 胰岛素分泌水平开始明显下降; 经过高糖 1 2 和2 4 h ; 培养的胰岛在恢复低糖浓度时，可以维持与未经过高糖培养的胰岛相近的胰 岛素分泌水平;而经
16、过7 2 h r 高糖培养的胰岛， 激素分泌水平下降最为明显。上述现象说明经过 高搪4 8 h r 培养的胰岛，开始出现不可逆性胰岛素分泌水平衰减。由S R I 值变化表明随高糖刺激 时间延长，胰岛对葡萄糖浓度变化的敏感性明显下降。对比于未经过低糖培养的胰岛， 在高糖 刺激2 4 h r 以内恢复低糖培养可以使S R I 值略有上升，也就是说经过低糖培养， 胰岛对葡萄糖的 刺激敏感性得到部分恢复。但经过高糖4 8 h r 刺激的胰岛在恢复低糖培养时， S R I 值无明显变化， 即此时胰岛对葡萄糖刺激的敏感性无法通过改变环境中的葡萄糖浓度来恢复， 也就是说胰岛功 能出现了 不叮逆性疲劳。 3 结论 葡萄糖浓度是影响体外培养胰岛的分泌功能和胰岛对葡萄糖敏感性指数的主要因素。低糖 浓度时，胰岛可以维持相对稳定的胰岛素分泌水平和S R I 值;在高糖环境下，胰岛的分泌功能和 S li l 仇都会随培养时间的延长而迅速下降。胰岛经过
