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1、山东大学 博士学位论文 蛛网膜下腔细胞因子转入防治脊髓缺血再灌注损伤的实验研究 姓名：于灵芝 申请学位级别：博士 专业：心脏外科 指导教师：郭兰敏;徐建国 20040422 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 、 论文作者签名：三主邋! 日期：巡! 幺! 至 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向
2、国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名弛导师签名：袒 日期。塑! ! 堡蟹 山东大学博士学仿论文 蛛网膜下腔细胞因子转入防治脊髓缺血再灌注损伤 的实验研究 博士研究生于灵芝 指导教师郭兰敏徐建国 摘要 该课题为山东省自然科学研究基金资助项目( Y 2 0 0 2 C 4 4 ) 背景：胸、腹主动脉瘤( T A A A ) 是一种常见的心血管疾病，手术是最主要的治疗方 法。截瘫是该类手
3、术极其严重的并发症。文献报道其发生率在4 - 一4 0 不等。手术导致 截瘫的因素很多，但归根结底是阻断主动脉期问脊髓缺血和开放后的再灌注损伤所导致 的一系列病理生理变化。虽然临床上也在术前、术中、术后采取了多种保护措施，在一 定程度上对脊髓损伤起到保护作用，但均不能满意地降低T A A A 手术截瘫的发生率，其 原因是未能从根本上解决脊髓缺血所带来的问题。而这些措施的本身多操作较为复杂 也带来了一定的副作用和并发症。I 鞫此我们仍需继续寻找更简便更加有效的脊髓保护方 法。 目的：为探索有效防治主动脉瘤手术中脊髓缺血再灌注损伤的措施，用大鼠制作脊 髓缺血模型，探讨脊髓缺血再灌注后不同时间段血清
4、血管内皮生长因子( V E G F ) 、内皮抑 素( e n d o s t a t i n ) 和脑源性神经营养因子( B D N F ) 以及脊髓相关受体表达的变化规律，探索 蛛网膜下腔细胞因子转入的防治作用及其机理。 方法： W i s t a r 大鼠，体重2 0 0 2 5 0 9 ，采用N a s l u n d 腹主动脉阻断方法建立脊髓缺血动物 山东大学博士学位论文 模型。 1 、对照( C ) 组，动物8 只，只解剖出腹主动脉，放置阻断带后不阻断。 2 、模型( Z ) 组，共4 8 只，于肾动脉分权下方阻断腹主动脉3 0 m i n ( Z I 组) 和9 0 m i n
5、( Z I I 组) 制作脊髓缺血损伤模型，分别于开放后6 8 h ，2 d ，7 d 留取标本后处死动物。 3 、治疗组( V 、B 、V B 、V B O 、N S ) ，各1 6 只，共8 0 只。分别于阻断前、后经蛛网 膜下腔注射重组鼠血管内皮生长因子( r r v E G P 5 ，V 组) 、重组人脑源性神经生长因子 ( r h B D N F ，B 组) 、或相同容量和剂量的r r V E G F ”5 + r h B D N F 混合液( V B 组) ，安慰剂对照 ( N S ) 组以等容量生理盐水作为对照，主动脉阻断9 0 m i n 后开放；并设立非缺血治疗对 照组，即只
6、给予蛛网膜下腔注射等容量剂量的r r V E G F “5 + r h B D N F 混合液，但不阻断腹主 动脉( V B O 组) 。分别于手术后6 8 h 、7 d 动物处死前取血液、脊髓标本。 4 、检测方法与指标包括：光镜下观察脊髓组织的病理改变；R T P C R 法检测脊 髓组织中V E G F K D R 受体m R N A 、T r k B 受体m R N A 的表达；E L I S A 法检测皿清B D N F 、V E G F 和内皮抑素( e n d o s t a t i n ) 水平。 结果： 1 、脊髓病理检查： 。 1 ) Z I 组主要表现为再灌注6 8 h
7、的轻度水肿，少数细胞尼氏体溶解，第二天可 见轻度炎性反应，第七天基本恢复正常。 2 ) Z I I 组则表现为较重的细胞缺血水肿，体积增大，多数细胞尾氏小体减少或 消失，部分神经元出现核深染。呈坏死前改变；再灌注第二天较多神经元细胞坏死， 炎性侵润严重；第七天不同个体有一定差异，严重者运动神经元数量减少，神经元明 显坏死，灰质呈海绵样改变，部分区域核溶解、消失或核膜不清，只可见核的影子， 少数细胞边界不清，呈细胞溶解前改变，但也有部分神经元结构正常。 3 ) N S 组与Z I I 相似。 4 ) V 、B 、V B 组的缺血坏死改变均较Z I I 组轻，尤以V B 组最轻，且再灌注第 2 山
8、东大学博士学位论文 七天绝大多数神经元存活良好。 2 、血清B D N F 含量与脊髓T r k B 受体的表达 1 ) 正常对照( C ) 组血清B D N F 水平为2 3 9 3 2 2 4 2 7 3 1 p g m 1 ，T r k B 表达的半定 量结果为0 6 4 1 7 0 2 3 6 5 。 2 ) Z 1 组再灌注6 8 h 和2 天，血清B D N F 均无明显的变化，第七天增高达3 4 1 4 ，6 1 4 9 2 ，9 8 p g m l ，与C 组以及前两时间点比较，均p 0 0 5 ，故尚不能认为有相关性。 3 血清内皮抑素水平与e V 比值 3 1 C 组：不阻
9、断的正常对照组血清内皮抑素水平为5 6 5 2 1 0 2 8 n g m l 。 3 2 模型组 3 2 1z I 组：缺血3 0 m i n 再灌注各个时间点血中内皮抑素含量的变化为，6 8 h 时略有降低，为4 9 6 q - 4 9 2 n g m l ，2 天时回升至6 2 8 8 + 8 7 2 n g m l 一， 7 天时又降至 正常水平5 8 2 0 1 4 4 0 n g m l 一，与C 相比，均p O 0 5 ，差异无显著性意义。该组e v 比值为( 2 9 9 6 0 士1 7 1 8 2 ) “ 1 0 3 。 3 2 2Z I I 组：缺血9 0 r a i n
10、再灌注6 8 h ，血中内皮抑素水平变化不明显( 5 6 9 6 1 4 3 2n g ，m l 。1 ) ，但从第二天开始有明显上升，达8 4 8 0 1 6 9 6 n g m l ，高于c 和z I 同时间点，p 0 0 5 ，无显著性差 异：与Z t I 组相比，7 d 时明显降低，p F 0 1 5 7 2 O ，1 6 6 5 O O O l 8 结论为注入B D N F ，V E G F 后尚不能认为对T r k B 受体有作用，但二者有交互作用，二者同时 用，虽尚不能认为对T r k B 受体有作用，但同时用与二者单独用的作用有显著差异性 ( P F 0 0 0 0 l 0 0
11、 3 4 2 0 4 9 2 8 山尔大学博士学位论文 A n a l Y S iSo fV a r l a n c eP r o c e d u r e D e p e n d e n tV a r i a b l e ：X S o u r c eD FA n o v aS SM e a nS q u a r e FV a l u eP r F A10 0 0 1 3 6 5 0 10 0 0 1 3 6 5 0 10 0 9 0 7 6 2 2 Bl0 0 0 2 5 1 3 7 20 0 0 2 5 1 3 7 2 0 ，1 70 6 8 1 6 A * B10 0 0 5 8 2 6
12、2 60 0 0 5 8 2 6 2 6 0 4 00 5 3 31 注：v 2 ，B 2 ，N S 2 ，V B 2 四组进行2 * 2 析因设计分析结论为注入B D N F ，V E G F 后尚不能认为对 V E G F 受体有作用，且二者没有交互作用。 表析3 1 血清B D N F 水平的V 1 ，B 1 ，N S l ，V B l 四组 D e p e n d e n tg a r i a b l e ：X S o u r c eD FA n o v aS SM e a nS q u a r e Al1 5 8 1 5 7 5 5 8 81 5 8 1 5 7 5 5 8 8 Bl
13、1 3 0 1 2 8 7 81 3 0 1 2 ，8 7 8 A * Bl5 4 9 9 6 6 9 0 3 85 4 9 9 6 6 9 0 3 8 A n a l y s i So fV a r i a n c eP r o c e d u r e 注入B D N F ，V E G F 后对血清中B D N F 均有作用，且二者有交互作用， 作用弱于单个用药。 FV a l l i e 7 4 8 O 0 6 2 6 0 0 P r F O 0 1 0 7 0 0 0 5 9 0 0 0 0 1 不过二者共同用药，其 表析3 2 血清B D N F 水平的V 2 ，B 2 ，N S 2
14、，V B 2 四组 A n a l Y S i S0 fV a t i a n c eP r o c e d u r eD e p e n d e n tV a r i a b l e ：X S o u r c eD FA n o v aS S M e a nS q u a r eFV a l u eP r F A l1 8 5 7 9 0 8 41 8 5 7 9 0 8 41 0 70 0 0 9 0 B16 7 1 4 3 7 1 7 4 6 7 1 4 3 7 i 7 43 8 8 00 0 0 0 l A * Bl1 0 5 5 9 4 2 5 O t 1 0 5 5 9 4 2 5
15、 O l6 1 0 10 0 0 0 1 结论为注入B D N F ，V E G F 后均对血清B D N F 有作用，且二者有交互作用，不过二者共同用药 其作用弱于单个用药。 相关1 K D R ( V E G F B 为有相关性。 T h eS A SS y s t e m P e a r s o nC o r r e l a t i o n a c t i n ) 与T r k B p a c t i n 相关性比较P = O 2 0 4 2 0 0 5 ，故尚不能认 2 C o r r e l a t i o nA n a l y s i S 2 V A R V a r i a b l
16、 e s ：AB C o e f f i c i e n t s P r o b f R fu n d e rH o ：R h o = O N = 8 4 山东大学博士学位论文 A B A l ，0 0 0 0 0 O O 一0 1 3 9 9 6 0 2 0 4 2 B O ，1 3 9 9 6 0 2 0 4 2 1 0 0 0 0 0 O 0 相关2 K D R ( V E G F B a c t i n ) 与V E G F 相关性比较P = O 4 4 8 9 0 0 5 ，故尚不能认为有相关 性。 T h eS A SS y s t e m C o r r e l a t i o n 2 V A R V a r i a b l e s ：A P e a r s o nC o r r e l a t i o nC o
