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1、 重组门冬酰胺酶的制备摘要：L-天冬酰胺酶具有显著的抗肿瘤作用，尤其是广泛应用于儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的治疗。采用渗透振扰破壁法、硫酸铵分级沉淀、乙醇分级沉淀、DEAE-纤维素层析等步骤提取和纯化重组 L-门冬酰胺酶。关键字：L-门冬酰胺酶; 制备；分离;纯化；稳定剂1.L-天冬酰胺酶治疗 ALL 的作用机制L-天冬酰胺酶(E.C，3.5.1.1)是酰胺基水解酶，是 1 个广泛应用于儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗的酶类药物。L-天冬酰胺酶在机体内可催化天冬酰胺的水解，生成天冬氨酸和氨，在大量的 ALL 病人中，其肿瘤细胞依赖外源性的 L-天冬酰胺才能生存，而正常细胞自身能合成
2、L-天冬酰胺。L-天冬酰胺酶抗白血病的作用机制是它能够快速消耗血循环中的 L-天冬酰胺，从而消耗肿瘤细胞合成蛋白质所必需的底物，快速抑制蛋白质合成，而不影响正常细胞，此即 L 天冬酰胺酶的选择性细胞毒作用。12. L-天冬酰胺酶的分离纯化工艺2.1 酶的几种提取方法L-天冬酰胺酶最初是从豚鼠的血清中提取的，含量很低，后来开发发酵法生产，采用大肠杆菌;欧文菌以及粘质赛氏杆菌( serraliamarcescem)等产生菌制备。大肠杆菌产生的 L-天冬酰胺酶包括天冬酰胺酶 I 和天冬酰胺酶，其中天冬酰胺酶 I 没有抗癌活性，存在于细胞质中，而有抗癌活性的天冬酰胺酶则分泌到细胞周质中。大肠杆菌来源的
3、天冬酰胺酶的提取方法常用有冷丙酮干燥破壁、蔗糖溶液提取法和反复冻融法、超声破壁 法等.2.1.1 蔗糖溶液提取法向菌体细胞中加入 5 倍体积的蔗糖抽提液 (蔗糖 40%，溶菌酶200mg/L，EoTA10mmol/L，pH75)，在 30C 振荡 2 小时， 8000r/min 离心30 分钟，收集上清酶液。2.1.2 冷丙酮干燥破壁法将菌体悬液倒入 10 倍量预先冷却的丙酮中，搅拌 15 分钟，5000r/min 离心 20 分钟收集沉淀，于室温风干、研碎。向菌体干粉中加入 10 倍体积0.0lmol/L，pH8.0 硼酸缓冲液.于室温下搅拌 30 分钟，加入氯化锰溶液沉淀核酸，离心收集上清
4、酶液。2.1.3 反复冻融法将菌体在-30C 和室温两种温度反复冻融 9 次，用 30mmol/L 磷酸缓冲液(pH7.5)浸提 30 分钟，8000r/min 离心回收上清酶液。1.5.4 超声破壁法l 克湿菌体悬浮在 40 毫升 10mmol/L、pH7.5 磷酸缓冲液中，超声处理(输出 300W，超声 10 秒，间隔 30 秒)20 分钟。处理过程中用冰浴降温。用氯化锰沉淀核酸，400or/min 离心 20 分钟回收上清酶液。由刘景晶等2实验验证蔗糖溶液提取法的提取收率最高。2.2 酶的纯化为了保护酶的活性在固相分离沉淀时采用较为温和的硫酸铵分级沉淀具 体方法为用蔗糖溶液提取法获得的酶
5、液，加入硫酸按至 55%饱和度，调pH 至 7.0，室温搅拌 1 小时，离心除去沉淀。上清液中加入硫酸按到 90%饱和度，离心收集沉淀。实验验证破壁液中酶浓度高于 378 IU/ml 时, 酶易与杂质-起沉淀,回收率下降,但过低时,虽然回收率增高, 但杂质的去除率必定会下降,故应选择 378 IU/ml 左右进行沉淀。在 pH 为 4.9 时, 盐析的沉淀效果最好,回收率达 89.1%。沉淀物用 50mmol/L、pH7.0 磷酸缓冲液溶解并透析。透析后的酶液通过预先用 10mmof/L、pH7 6 的磷酸缓冲液平衡的 DEAE-纤维素 DE52 层析柱 (r.0 又 30em)。用 30mm
6、ol/L 磷酸缓冲液洗脱，流速为 40ml/h。收集显示天门冬酰胺酶活性的组分。将洗脱液调 pH4.8，通过预先用 50mmol/L、pH4.9 磷酸缓冲液平衡的 cM-纤维素 eM52 层析柱(1.0X8.oem)，用 50mmof/L、pH5.2 磷酸缓冲液洗脱，收集显示天门冬酰胺酶活力的组分，冻干后得天门冬酰胺酶冻干粉。由蔡丽萍等3研究发现在 DEAE-Sepharose 层析柱纯化之后增加-个亲和层析。亲和层析柱对 L-天门冬酰胺酶的专-吸附性大大提高了分离纯化的分辨率。2.3 冻干状态下酶保护剂的选择王宏等4实验证明, 在溶液状态下酶与甘露醇之比为 12(WW) 时,在冻干状态下酶与
7、甘露醇之比为 11(WW)时,保护作用最佳。与无稳定剂酶组相比,溶液状态及冻干状态的 t250.9 分别增加 16.5 倍和 7 倍. .3 蛋白质浓度测定按 Lowy 法用 Folin 酚试剂测定。4 高效毛细管电泳Waters Quanta 4000E 石英毛细管 ,l=37.5cm。流动相 80 mmol/L PO3-4,pH7;电压 12 kV,电流 68A,进样方式及时间 H/10s,检测波长 214 nm。 参考文献1吴晓英，吴振强，林影，夏枫耿.L-天冬酞胺酶的研究进展J 广东药学 2003 年第13 卷第 6 期2 刘景晶, 金健勤,戴海滨, 吴梧桐. 大肠杆菌 L-天门冬酸胺酶的提取和纯化 J 药物生物技术 1995，2(l)3 蔡丽萍,杨冠东 ,卢勇涛,杜少平. L-天门冬酰胺酶的提取和纯化工艺改进 J 广东药学2002 年 12 卷第 5 期4 王弘 ,吴梧桐,刘景晶,顾学裘 重组 L-天冬酰胺酶制剂稳定性研究J 药物生物技术1997,4(2)
