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1、丹皮酚的含量测定及其分析方法的验证李超 中药学 2015201225004摘要：丹皮酚是常用中药牡丹皮、徐长卿、芍药等中药中的主要挥发性成分之一，是衡量牡丹皮、徐长卿等中药材及其组方的多种制剂质量控制的重要指标。为评价丹皮酚药材及其复方制剂的质量，人们对丹皮酚的测定方法进行了许多研究。该文就丹皮酚的含量测定及分析方法进行了评述与探讨。关键词：丹皮酚；含量测定；分析方法丹皮酚(paeonol)为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的根皮及萝摩科植物徐长卿Cynanchum paniculatum(Bunge)Kitagawa.的根或全草中的挥发性成分之一。为小分子酚
2、类化合物，白色或微黄色有光泽的针状结晶，化学名称为2-轻基-4-甲氧基苯乙酮（如图1，分子式为C9H10O3；分子量166.18）。气味微辣，极性较低，熔点49-51，易溶于乙醇和甲醇，溶于乙醚、丙酮、苯、氯仿及二硫化碳中，稍溶于水，不溶于冷水，在热水中可溶解，能随水蒸气挥发1。丹皮酚味苦、辛，丹皮酚具有抗心律失常、抗动脉粥样硬化、抗血栓形成、扩张管、降血压、降血糖等，还具有抗炎、抗菌抗病毒及调节免疫功能等作用2。丹皮酚是衡量牡丹皮、徐长卿等中药材及以其组方的多种制剂质量控制的重要指标。2015版药典规定牡丹皮按干燥品计算，含丹皮酚不得少于1.2%，徐长卿按干燥品计算，含丹皮酚不得少于1.3%
3、3。为评价含丹皮酚药材及其复方制剂的质量，人们对丹皮酚的测定方法进行了许多研究。本文就丹皮酚的含量测定的分析方法作一概述。1薄层扫描法薄层扫描法准确、灵敏，重现性好，专属性强，可作为其质量控制标准。章睿4等以丹皮酚为对照品，建立了牡丹皮药材及其饮片的薄层扫描特征图谱，该方法简便、设备价廉、分析速度快等，易于使用，尤其适合对大批原料药材进行分析。宋飞5用硅胶G薄层板以双波长薄层扫描测定六味地黄丸中丹皮酚含量，展开剂为环乙烷:氯仿:无水乙醇(7：3：1),显色剂为5%酸性FeCl3,扫描条件为s=400nm,R=700nm,反射法锯齿扫描精密度试验结果平均值为16926.6,RSD=2.8%(n=
4、6)；稳定性实验结果表明在1h内稳定。回收率为93.12%,RSD为3.44%(n=5)。苗方6等用此法测定了观赏牡丹中，丹皮酚的含量为1.5mg/g,加样回收率为97.6%,RSD为1.15%。空白干扰试验表明本测定无明显干扰;相关系数R=0.9987表明在其范围呈现良好的线性关系;对照品和供试品斑点在测定时间100min内斑点稳定,峰面积积分值基本不变;精密度试验结果平均值为1.165mg/g,RSD=1.76%(n=6),表明重复性良好;加样回收率试验结果测定的平均回收率为97.60%,RSD为1.15%(n=5)。2激发荧光扫描法扫描法多在(2741)nm处进行扫描测定，供试品溶液的浓
5、度相对较高(0.5mg/mL)，线性范围在15g，对丹皮酚含量低微的样品，扫描法根本无法检出。遇到高效液相法丹皮酚波峰有干扰的情况下，定量测定就更难以进行。为开发丹皮酚不同形式的、高灵敏度测定方法，对丹皮酚进行增荧光后，荧光薄层扫描定量测定研究，获得理想的测定结果，大幅度提高了丹皮酚的检测灵敏度以及方法的重现性和精密度。李晓燕等7以激发荧光扫描法测定微量丹皮酚。用硅胶G薄层板，以环己烷-乙酸乙酯-丙酮-甲酸(8:2:1:0.2)为展开剂，三氯化铝试液为增荧光剂，进行了微量丹皮酚的荧光扫描定量测定研究。结果显示丹皮酚最佳激发波长为292 nm，点样量在0.04020.1809g范围内呈良好的线性
6、关系(r=0.999 7)，同板精密度试验中RSD为1.59%，样品的RSD为0.81%；异板精密度试验中样品的平均含量为25.68 mg/g，RSD为1.31%；仪器精密度试验中照品的RSD为0.59%，样品的RSD为0.09%，表明仪器性能良好。稳定性试验在考察的1.5 h内，对照品的RSD为2.39%，样品的RSD为2.68%。重复性试验中样品丹皮酚的平均含量为25.62 mg/g，RSD%为1.83%，表明方法重复性良好。平均回收率为101.80%,RSD为1.58%(n=9)。此法简便、准确，灵敏度高，适用于微量丹皮酚样品的测定。3气相色谱法气相色谱法是一种在有机化学中对易于挥发而不
7、发生分解的化合物进行分离与分析的色谱技术，所以非常适合对牡丹皮中丹皮酚进行详细的分析8。刘向红9以气相色谱法测定丹皮酚原料及片剂的含量。采用GC内标法,色谱柱为3.2 mm210mm玻璃柱,固定相为聚乙二醇(PEG)-20000,;精密度试验结果表明方法精密度良好,RSD为0.64%(n=6)。平均回收率为99.9%，RSD=1.5%(n=9)；重复性试验结果表明方法重复性好，原料和片剂的RSD分别为0.81%(n=6)和1.34%(n=6)；溶液稳定性试验表明原料、片剂供试溶液在48 h内均稳定，原料和片剂的RSD分别为0.96%和1.24%(n=7)。本方法简便、准确、快速,可作为丹皮酚原
8、料及片剂含量的测定方法。石向群等10以气相色谱法测定桂枝茯苓胶囊中丹皮酚的含量。色谱柱为DB-624(0.53mmx30mx3N,m)，按外标法测定丹皮酚的含量，结果表明丹皮酚在20200g/mL浓度范围内与峰面积线性关系良好（R=0.9996），方法精密度试验SD%为1.00。计算样品丹皮酚平均含量为7.80 mg/g，RSD为1.29%。平均加标回收率为108.70%,RSD%为1.38(n=3)。4高效液相色谱法刘雯等11建立了测定原料中月皮酚含量的高效液相色谱方法。采用Agilent ODS C18(250 mm4.6 mm,5m)色谱柱，以纯水-甲醇(体积比为27:73)为流动相，流
9、速为1.0 mL/min，柱温35,检测波长274 nm。当流动相体积比为2773时，丹皮酚的保留时间约为4.927 min周围没有干扰且峰形良好。R=0.9999表明丹皮酚在0.02020 mg/mL范围内线性关系良好，即峰而积与进样量有良好的线性关系。根据信噪比S/N=3，测得丹皮酚的检出限为0.6 mg/L。精密度实验RSD为0.40%(n=6)，所测样品的精密度相对标准偏差较小，仪器精密度良好。结果表明，重复测定结果的相对标准偏差为0.4%，回收率在95%105%范围内。该方法的灵敏度高，准确性和重现性良好，有效消除了样品中其他组分对目标峰的干扰，线性范围宽，分离度好，可用来准确分析原
10、料中月皮酚的含量。冷英梅等12建立采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定不同产地牡丹皮中丹皮酚的含量方法采用Hypersil ODS2 C18色谱柱，以甲醇-水(45:55)为流动相，检测波长为274nm结果丹皮酚在0.00469.200g/L范围内呈现良好的线性关系。精密度实验表明精密度良好，RSD为1.46%(n=6)；稳定性实验表明供试品溶液中丹皮酚在12h内基本稳定，RSD为0.96%(n=6)；重复性实验表明此方法测定丹皮酚的含量，重现性良好，RSD为1.25%(n=6)。平均回收率为99.3%,RSD为2.16%(n=6)。本法简便、快捷、重复性好，可用于不同产地牡丹皮药材中
11、丹皮酚的含量测定回收率符合相关规定。兰保强等13采用HPLC法测定丹皮酚缓释片中丹皮酚的含量。方法色谱柱为Shim-pack VP-ODS柱(150 mm4.6mm,5m），流动相为甲醇-水(70:30)，流速1.0 mL/min，检测波长274 nm。结果丹皮酚0.0840.840g与峰面积的线性关系良好R=0.9999；精密度表明方法的精密度良好，RSD=0.24%(n=6)；重复性试验计算得丹皮酚含量的平均值为404.81mg/g，RSD=1.38%(n=6)。计算得丹皮酚峰面积的RSD=0.31%(n=8)，供试品溶液在24 h内稳定；平均回收率为99.20%,SD=1.60%（n=6
12、）。结论所用方法操作简单、结果可靠、重复性好，可较好地控制丹皮酚缓释片的质量。宋钦兰等14采用高效液相色谱法。色谱柱为Kromasil C18柱，流动相为甲醇-水(43:57,V/V)，流速为1.0 ml/min，检测波长为274 nm，柱温为25，进样量为10L。丹皮酚进样量在0.09304-0.4652g，R=0.9999)范围内与峰面积线性关系良好;精密度RSD=0.38%(n=6)表明仪器精密度良好;重复性实验中丹皮酚含量平均值为0.150 mg/g,RSD=1.56%(n=6)，表明本方法重复性良好；稳定性试验中丹皮酚峰面积RSD=1.08%(n=6)，表明供试品溶液在12h内稳定;
13、平均加样回收率为98.33%,RSD=0.81%(n=6)。该方法简便、准确、可靠，可用于糖肾康颗粒中丹皮酚的含量测定。5高效液相色谱紫外分光光度联用法闫一夫15等将色谱光谱仪联用(HPLCUV)法与斜投影法结合，建立了丹皮酚含量快速分析方法。通过色谱-光谱联用采集丹皮酚结晶母液的紫外多波长光谱三维数据，构建不含丹皮酚的背景数据库以及丹皮酚光谱数据库，基于斜投影法步骤测定了批量样本中丹皮酚含量。该方法计算结果和高效液相色谱分析结果接近，相对误差小于5.0%。测定结果的相对标准偏差为0.4%1.0%(n=5)，回收率为98.8%101.3%。该方法快速、准确，操作简单，可为丹皮酚结晶产品及各种制
14、剂质量控制提供可行方案。相对误差小于5.0%，说明该方法的准确度较高。测定结果的相对标准偏差为0.4%1.0%，说明该方法具有良好的精密度。6 紫外分光光度法高锦红16采用紫外分光光度法对牡丹皮中丹皮酚进行测定。取对照品溶液，以无水乙醇作空白对照，在200500 nm范围内进行紫外可见光扫描。丹皮酚在274nm处有最大吸收峰。线性关系考察R09999；精密度试验结果，吸光度平均值为0.662，RSD为0.19（n=6）；样品含量测定,平均检出量6.142g/mL,丹皮酚含量38.39mg/g。重现性结果RSD为0.32（n=6），表明该方法重现性良好。稳定性结果的RSD为0.18%（n=6），
15、样品在lOh内保持稳定；回收率的平均值为101.4，RSD为0.75（n=6），表明该方法的回收率较好，达到了测定要求，可用于牡丹皮中丹皮酚含量的检测。杨名宇等17为考察牡丹皮药材和饮片的有效期，以丹皮酚为检侧指标，采用紫外分光光度法，以274 nm为侧定波长。结果丹皮酚在2.4-12.0g/mL浓度范围内呈现良好线性关系，得回归方程，R=0.9999；重复性RSD为0.12%(n=5)与稳定性实验RSD=0.32%(n=5),A基本无变化。平均回收率为99.94%,RSD为0.12%(n=5)。我们还可以通过紫外分光光度法对不同生长年限、不同采收期丹皮中丹皮酚含量，揭示丹皮中丹皮酚的积累规律
16、，提示丹皮的最佳采收期18-19。7 近红外光谱丹皮酚含量的近红外定量分析模型建成之后，可简便、快速、无污染地测定丹皮酚的含量，结果准确可靠。该技术适用于杞菊地黄丸生产、流通等对检测结果要求时效性较强的各个环节，为其质量评价提供一种新的检测方法。白雁等20利用近红外光谱技术为杞菊地黄丸(浓缩丸)中丹皮酚含量，以杞菊地黄丸中丹皮酚含量的HPLC分析作为参照，结合最小二乘法(PLS)建立丹皮酚含量的定量分析模型。结果所建模型的相关系数(R)、外部验证均方差(RMSEP)和内部交叉验证均方差(RMSELV)分别为0.98089,0.06170和0.19403;验证集样品的NIR测定与药典法侧定的进行配对T检验，差异无统计学意义。所以近红外光谱法可用于杞菊地黄丸中丹皮酚含量的快速侧定。AOTF-NIR技术用于浓缩六味地黄丸浓缩液比重及丹皮酚含量分析，具有快
