流式细胞术和临床应用

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1、流式细胞术原理及临床应用 流式细胞仪(Flow Cytometer) 是现代物理电子技术、激光技 术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一 体的新型高科技仪器；当细胞（或其他粒子）以单个方式依次 通过探测光束时，能够采集细胞被光照时产生的各种信号，然 后对信号进行处理，并能对多个参数进行关联分析的一种仪器 流式细胞术(Flow Cytometry，FCM) 利用流式细胞仪对处于 快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数 、快速的定性、定量分析或分选的技术 流式细胞术 流式细胞术 激光技术、计算机技术、显微荧光技术、光电子技术、流体喷射 技术、单克隆抗体技术、纳米技术

2、以及分子生物学和免疫学等多 门学科知识 现代科学技术发展的综合交叉的产物，是集多种技术发展于一体 的“大成者” 广泛应用在免疫学、细胞遗传学、肿瘤生物学和血液学等多学科 领域 20世纪70年代发展至今，仪器设备更趋完善，在应用上也逐渐由 基础研究进入到临床检验医学领域，为细胞分析提供全新手段 1930 Caspersson G=R1 or R2; G=R1 not R2 （四）计算机和分析系统 十字门线性门 （四）计算机和分析系统 流式细胞术的最大特点是能在保持细胞及细胞器或微 粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的 协助，从分子水平上获得多种信号对细胞进行定量分 析或纯化分选 细胞不

3、被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量 流式细胞仪特点 目前国内主要流式细胞仪厂家 Beckton Dickinson(BD) BACKMAN COULTER Epics XL 单激光四色， 分析型 CyAn三激光九色，分析型 FC 500 单激光或双激光五色 ，市场覆盖率较高，分析型 Gallios 三激光十色，分 析型 MoFlo XDP 高端分选型 Beckman Coulter公司流式细胞仪 BD公司分析型流式细胞仪 FACS Calibur 双激光四色，市场覆盖率最高 FACS Canto II 双激光六色，三激光八色FACS Verse双激光六色，三激光八 色 AccuriC6

4、双激光四色 BD公司分析型流式细胞仪 LSRFortessa X-20 五激光 十八色，分析型最高配 LSR II 双激光六色，三激光八色， 四激光十色 FACSVantage SE FACSAria IIIInflux BD公司分选型流式细胞仪 BD FACS Canto II 双激光或三激光，8色分析 八角形/三角形光信号接受系统，利用全反 射的光路结构设计，避免透射过程对光信号 的损耗，提高荧光灵敏度 兼顾科研需求和临床检测 BD FACSTM 7-color setup beads使体外诊 断中所有实验的日常仪器设置在一管中进行 专门配备有FACSCanto临床软件，淋巴细 胞亚群，H

5、LA-B27等临床自动检测和分析软 件，直接报告检测结果 独立液流车系统，保持液流的稳定 最小样本量： 30微升 手动上样/自动连续上样 获得SFDA认证 BD LSRFortessa X-20 提供5激光，18色分析 18种波长的激光器，横跨从紫 外到红外全光谱范围，提供灵 活的光谱选择 满足高端科研需求 淋巴细胞亚群 HLA-B27 CD55、CD59检测 CD34造血干细胞计数 白血病和淋巴瘤免疫分型 TH1/TH2细胞检测 血小板活化 炎症感染指标CD64 网织红细胞/血小板检测 微小残留病灶（MRD） 肿瘤细胞倍体（DNA） 细胞凋亡 流式细胞术的临床应用 标本的种类： 血液、骨髓穿

6、刺液、各种体液（胸水、腹水、脑脊液）、组织（如淋巴 结、肝、脾）及肺泡灌洗液等 抗凝剂： 外周血：EDTA、肝素和枸橼酸均可 骨髓：肝素（推荐）、EDTA 血小板：枸橼酸 储存时间： EDTA：2448h 肝素：4872h 枸橼酸：72h 严重溶血、凝血或坏死的样本应弃用 单细胞悬液标本要求 淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析 试剂：BD Multitest IMK Kit 标本：外周血（常用） 配色：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC CD3-FITC/CD19-PE/CD45-PerCP/CD16CD56-APC 检测指标：T细胞（CD3+CD4+、CD3+

7、CD8-） B细胞（CD19） NK细胞（CD3-CD1656） 临床意义反应体内免疫状态 CD4+T降低：病毒感染、恶性肿瘤、免疫缺陷病、免疫抑制剂使用 CD8+T增高：病毒及结核杆菌感染，自身免疫性疾病活动期、肿瘤、 慢性活动性肝炎 CD4/CD8降低： 处于免疫抑制状态 免疫缺陷病：如艾滋病时的比值常显著小于0.5 某些恶性肿瘤：如肝癌、食道癌、肺癌、膀胱癌等 某些病毒感染：HBV、EB、CMV等 NK细胞（CD3CD16+和/或CD56+）能够介导对某些肿瘤细胞和病毒 感染细胞的细胞毒性作用 淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析 淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析 HIV感染者 HLA-B2

8、7HLA-B27检测检测 试剂：BD HLA-B27 Kit 标本：外周血 检测指标： T (CD3+)淋巴细胞上HLA-B27定性检测 临床意义： 强直性脊柱炎（高度相关，90%） Reiters 综合征（70-90%） 银屑病关节炎 （50-60%） 急性前葡萄膜炎（40-50%） HLA-B27HLA-B27检测检测 PNHPNH诊断诊断 试剂：CD59-FITC、CD55-PE 标本：外周血 检测指标：CD55、CD59百分比 CD55、CD59荧光强度 阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）的发病机制为X染色体上的PIG-A基因发生突 变，引起糖化肌醇脂（GPI）锚合成障碍，使GPI锚连

9、蛋白缺乏，已证实的GPI锚 连蛋白有10余种，用于PNH诊断的主要为CD55和CD59两种，如果在红细胞上出现 CD55或/和CD59的减少，可诊断为PNH Normal PNH PNHPNH诊断诊断 造血干细胞计数造血干细胞计数 试剂：BD Procount Progenitor Cell Enumeration Kit 标本：骨髓、动员后的外周血 配色：CD34-PE、CD45-PerCP、nucleic acid dye 检测指标：CD34及浓度 蓝色荧光微球（数量已知）；红色CD34细胞 干细胞特征： CD45表达弱阴性 (R2) CD34表达弱强 (R4) DNA/RNA含量多，染色

10、性较强 (R1) 大小（FSC）和颗粒度（SSC）淋巴细胞相似 临床意义： 血液系统疾病的造血干细胞移植 数量的检测 采集时机的确定 造血干细胞计数造血干细胞计数 白血病和淋巴瘤免疫分型白血病和淋巴瘤免疫分型 试剂：各种单克隆荧光抗体 标本：骨髓、外周血、胸腹水、脑脊液、淋巴组织 分型方案：CD45设门，四色标记， 临床意义： 客观、快速地分析 确定异常细胞系来源及分化阶段 判断预后 白血病和淋巴瘤免疫分型白血病和淋巴瘤免疫分型 正常骨髓细胞CD45/SSC R1: 淋巴细胞 R2: 幼稚细胞 R3: 单核细胞 R4: 中性粒细胞 R5: 有核红细胞 AML-M1AML-M1 R2占94，表达

11、 CD33,CD34,CD117,CD71,CD13, CD64,MPO ALL(BALL(B ) ) R2占65，表达 CD79a,CD19,CD34,CD22,CD10, CD38,HLA-DR 临床意义：CD4/CD8 结节病 特发性肺间质纤维化 肺部肿瘤疾病 肺泡灌洗液（肺泡灌洗液（BALFBALF）淋巴细胞检测）淋巴细胞检测 CD4/CD85.04 Th1/Th2Th1/Th2细胞检测细胞检测 Th1，抗胞内病原体 迟发型超敏反应、炎症 IL-2、IFN-、TNF- 介导细胞免疫 CD4+T Th1/Th2 Th2，蠕虫感染 环境变应原的应答 IL-4、IL-5、IL-10等 介导体

12、液免疫 TH1/TH2TH1/TH2细胞检测细胞检测 细胞内细胞因子表达 IFN-（Th1）和IL-4（Th2） 检测前需要刺激活化（PMA + ionomycin）46h Golgistop，含有莫能霉素（Monensin） 设门策略：CD3+CD8- TH1/TH2TH1/TH2细胞检测细胞检测 感染性疾病感染性疾病CD64CD64检测检测 CD64：FC受体 单核细胞（） 中性粒细胞（dim） 淋巴细胞（） 检测指标：中性粒细胞CD64表达强度 CD64指数CD64中性粒/CD64淋巴 临床意义：细菌感染、脓毒血症、败血症 感染性疾病感染性疾病CD64CD64检测检测 CD45CD64 CD64CD64CD64 液相芯片技术液相芯片技术CBACBA CBA： Cytometric Bead ArrayCytometric Bead Array 可溶性蛋白 ：血清中细胞因子 荧光微球连结特异抗体 不同荧光强度 多个检测指标 标本：血清、血浆、培养液、各种体液 液相芯片技术液相芯片技术CBACBA 液相芯片技术液相芯片技术CBACBA 思考题 1、FSC和SSC分别分别反应了细胞的什么特点？ 2、外周血淋巴细胞亚群分析的临床意义？ 知识回顾知识回顾 Knowledge Knowledge ReviewReview