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1、实验四 玉米种子盐溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 2014.1.2 一、目的要求 了解玉米种子盐溶蛋白提取方法、电泳程序、 染色和鉴别方法。 二、原理和依据 利用不同带电质点在一定电场中的迁移速度不 同进行分离，凝胶电泳除了电荷效应，还有分子 筛效应和PH梯度等。 三、材料、仪器和试剂 材料： 玉米种子。 仪器： 电泳仪，电泳槽，离心机，离心管，1/1000电 子天平或分析天平，样品钳，广口瓶，移液管及移液管 架，微量进样器（1-50l），注射器等电泳用品。 试剂： 丙烯酰胺（Acr），亚甲基丙烯酰胺（Bis）， 甲酸，甲酸钠，过硫酸铵（APS），四甲基乙二胺（ TEMED），NaCl，蔗糖，甲
2、基绿，甘氨酸，考马斯蓝 R250，三氯醋酸（TCA），乙醇（96%），乙酸（99%） 等。所有化试剂都需是分析级或以上等级。 四、方法和步骤 1溶液配制 （1）凝胶溶液的配制 贮备液A（分离胶贮备液）：称取90g Acr，3g Bis， 加入去离子水350ml，搅拌至完全溶解（约30min）后定 容到500ml，放入棕色瓶中低温保存。 贮备液B（分离胶缓冲液）：吸取含量88%的甲酸 0.427ml，称取甲酸钠（含2个结晶水）1.0456g，加入 50ml去离子水，搅拌混匀，并定容到100ml，并调节pH 至3.2，倒入棕色瓶中低温保存。 贮备液C（分离胶化学聚合催化剂1%APS）：称取 2gA
3、PS，加入100ml去离子水，搅拌至完全溶解，并定容 到200ml，倒入棕色瓶中低温保存，仅能保存1周。 贮备液D（浓缩胶贮备液）：称取9.3gAcr和0.31gBis，先 加入30ml去离子水，搅拌至完全溶解，再定容到50ml，倒入 棕色瓶中低温保存。 贮备液E（浓缩胶缓冲液）：吸取含量为88%甲酸 0.218ml，称取甲酸钠0.5228g，加入30ml去离子水溶解，并 定容到50ml，调节pH至5.6。倒入棕色瓶中低温保存。或者 先溶解甲酸钠，然后用甲酸滴加，调节pH至5.6。 贮备液F（浓缩胶聚合催化剂1%APS）：称取1gAPS，先 用60-70ml去离子水溶解，搅拌至完全溶解后定容到
4、100ml， 倒入棕色瓶中低温保存。仅能保存1周。 贮备液G（凝胶聚合加速剂TEMED）：吸取1mlTEMED， 加去离子水1ml溶解，放入冰箱低温保存。 （2）样品提取液的配制 称取0.2928g NaCl，20g蔗糖和0.04g甲基绿，加去离子 水溶解，充分搅拌至溶解，定容到100ml。（稀盐溶液 ） （3）电极缓冲液配制 吸取含量为88%甲酸溶液8.54ml，称取甘氨酸6.006g， 先用1600ml去离子水溶解后定容到2000ml，混匀并调节 pH至3.45备用，可重复使用5次（或先将甘氨酸溶解， 然后滴加甲酸，调至pH3.45）。 （4）蛋白质染色液配 称取1g考马斯亮蓝R250，先
5、用95%酒精溶解至100ml，另 用去离子水配制10%（W/V）的TCA溶液。使用之前吸取1%考 马斯亮蓝液3.5ml于100ml的10%TCA溶液中，配成一块凝胶板 染色液。 注：该染色液具有固定和染色两种功能。必须在放入凝胶 染色前再混合。 （5）凝胶贮备液配制 贮备贮备液编编号 分离胶浓缩浓缩胶 配比一块块板取液量配比一块块板取液量 A515ml B13ml C26ml D11ml E11ml F22ml G80ul40ul40ul 2. 操作技术 （1）样品制备： 取单粒玉米种子，在单粒样品磨碎仪上粉碎后，收集到 1.5ml离心管中，按约11的量用洗瓶或滴管加入样品提取液 ，摇匀，放置
6、5min后，再摇一次，5000rpm离心15min，取上 清液点样。在做玉米品种测定时，可不用离心，自然沉降 30min后，取上清液即可，该样品浸提在冰箱中进行更好。 点样后样品可放入冰箱中保存两天，再电泳时，只需将样品 重新摇动一次就行。一般加样30-50ul。 （2）凝胶制备: 电泳槽准备： 垂直板夹芯电泳槽安装比较简便，先将玻璃装入 橡胶封条中，然后插入有机玻璃制成的电泳槽中， 拧紧螺栓，固定好成胶模。 此步操作要注意玻璃板必须洗干净，而且要干燥 ，手指不能接触玻板表面，操作时可戴细纱手套用 或用手拿住玻板棱，另外，胶模在电泳槽中要放水 平，位置合适，以防漏水。 配胶： 从冰箱中取出凝胶
7、贮备液，根据电泳槽的大小，按表 4中的比例取出一定体积的分离胶各贮备液混匀，同样 取出浓缩胶溶液，混匀，G液先不加入，将各贮备液再 放回冰箱。 注意取贮备液用的移液管要分别使用，不能混用。 封底缝： 为了使胶和下槽相通，成胶模下边有一条底缝，灌 制分离胶前必须先将底缝用胶封住，根据底缝大小， 取适量分离胶混合液，加入适量G液（用微量注射器 加入），然后迅速摇匀，沿下槽玻板外壁倒入，将底 缝封住。将电泳槽在实验台面上振动一下，使底缝封 平。对于多个电泳槽的封底缝可用同时进行。一般5- 10min，分离胶就会聚合将底缝封住。 灌分离胶： 封底后，用滤纸条插入两玻板之间，吸去因成胶而析出 的水，从分
8、离胶混合液中取出一块板的胶量，按比例加入 G液，迅速摇匀，将电泳槽倾斜，将分离胶混合液倒入两 玻板之间达一定高度（距玻板上边约1.0-1.5cm）。灌胶过 程中注意不能产生气泡，如出现气包可用细不锈钢丝快速 挑出。灌胶后，用预先准备好的注射器注水封住胶面，水 封的动作必须要轻，不能冲坏胶面，当水封后，分离胶和 水层间有一界面，等一下界面消失，再出现界面时表明凝 胶已成，此时倒出封水，用滤纸吸干，注意滤纸不能接触 胶面。 灌浓缩胶： 取适量浓缩混合液，按比例加入G号溶液，迅速摇匀 ，灌入电泳槽中，插好事先准备的样品刷，用夹子夹 住。该胶聚合很快，故动作要快，样品梳要插平。 加样： 浓缩胶聚合后，
9、倒入电极缓冲，上槽电极缓冲液面要 高于短玻板，然后小心拔出样品梳，用微量进样器吸取 20-30ul玉米蛋白提取液的上清液依次在样品槽中点样， 每点一个样要清洗微量进行器。 电泳： 点样完毕，将电源线正极接上槽，负极接下槽，接通冷 却水，打开电泳仪电源开关，采用稳压方式，调节电压 300-600V。 注意电源正负极不能接反，电泳开始后，观察电泳情况 ，刚开始甲基绿在浓缩胶中会浓缩成一条细线，进入分离 胶后，甲基绿开始扩散电泳至槽底部距胶底部边缘0.5- 1.0cm处时，关闭电泳仪（一般电泳时间为1.0-1.5h）。 卸板： 倒出电极缓冲液，拧松固定螺杆，将玻璃板和密封胶带一 同取出，卸下密封胶带
10、，用不锈钢刀小心撬开玻板，如发生 粘板，用长针头注射器一边注射水一边剥离，剥离完后将凝 胶板倒入染色液中，用刷子将胶板完全按入染色液中。 染色： 该染色方法快速，本底不着色，一般染10-30min就可观察 谱带，完全染色则需要4h以上的时间。该染色液中考马斯亮 蓝R250呈悬浮状，在染色过程中会沉集在胶板和染色盘底， 可重复使用。 洗板： 将染好的胶板用铲子铲出，放在白瓷砖上。若胶 面沉集有染料，影响结果观察，可用刷子沾取0.5% （W/V）的洗衣粉来洗刷胶表面，然后用自来水冲 洗干净，可观察结果。 3. 观察结果： 对比待鉴定种子和已知真实种子或父母本 的蛋白谱带来鉴定品种，可根据杂交种的数 量计算出纯度，同时也可统计异交种和自交 种粒数。 五、思考题 1应用电泳鉴定品种的理论基础是什么？ 2. 如何根据电泳图谱鉴定结果判断玉米种 子的真实性和纯度？
