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1、实验六实验六 微生物细胞的大小测量和显微计数微生物细胞的大小测量和显微计数 主主 讲讲: :徐尔尼徐尔尼 生命科学学院生物技术系生命科学学院生物技术系 一、目的与要求一、目的与要求 学习测微尺测定微生物细胞大小，以及血球计数板学习测微尺测定微生物细胞大小，以及血球计数板 计算微生物细胞数目的原理。计算微生物细胞数目的原理。 掌握使用测微尺和血球计数板对微生物细胞进行大掌握使用测微尺和血球计数板对微生物细胞进行大 小测量和细胞计数的方法。小测量和细胞计数的方法。 增强微生物细胞大小的感性认识。增强微生物细胞大小的感性认识。 二、基本原理 1 1、微生物细胞大小的测量、微生物细胞大小的测量 微生物
2、细胞的大小是微生物基本的形态特征，也微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也 是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要 在显微镜下，借助特殊测量工具在显微镜下，借助特殊测量工具测微尺（包括测微尺（包括 镜台测微尺和目镜测微尺镜台测微尺和目镜测微尺）。）。 测微尺原理：测微尺原理：镜台测微尺镜台测微尺是中央部分刻有精确等是中央部分刻有精确等 分线的载玻片，一般是将分线的载玻片，一般是将1mm1mm等分为等分为100100格，每格长格，每格长 0.01mm(0.01mm(即即10m)10m)。镜台测微尺并不直接用来测量细。镜台测微尺并不直接用来测量
3、细 胞的大小，而是用于胞的大小，而是用于校正校正目镜测微尺目镜测微尺每格的相对长每格的相对长 度，然后再用目镜测微尺测量微生物细胞的大小。度，然后再用目镜测微尺测量微生物细胞的大小。 二、基本原理 2 2、显微直接计数、显微直接计数 显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液 置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（ 又称计菌器），于显微镜下直接计数的一种简便、又称计菌器），于显微镜下直接计数的一种简便、 快速、直观的方法。快速、直观的方法。 血细胞计数板原理：计数板是一块特制的载玻血细胞计数板原理：计数板是
4、一块特制的载玻 片，其上由四条槽构成三个平台，中间较宽的平台片，其上由四条槽构成三个平台，中间较宽的平台 又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各该有一又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各该有一 个方格网，每个方格多共分为九个大方格，个方格网，每个方格多共分为九个大方格，中间的中间的 大方格即为计数室。大方格即为计数室。 二、基本原理 每个计数室（大方格）边长为1mm，则每个大方 格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之 间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3（即 万分之一毫升）。 每个计数室有25或16个中方格。计数时，通常数 五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的
5、平均值 ，再乘以25或16，就得出一个大方格的总菌数，然后 换算成1ml菌液中的总菌数。 三、实验器材三、实验器材 1 1、菌种：、菌种：酿酒酵母菌液酿酒酵母菌液、细菌三形片细菌三形片 2 2、试剂：、试剂：无水乙醇、香柏油、二甲苯无水乙醇、香柏油、二甲苯 3 3、仪器或其他用具：、仪器或其他用具：目镜测尺、镜台测微尺、血球目镜测尺、镜台测微尺、血球 计数板、盖玻片、无菌吸管、酒精灯、显微镜、擦计数板、盖玻片、无菌吸管、酒精灯、显微镜、擦 镜纸、滤纸等镜纸、滤纸等 四、操作步骤四、操作步骤 1 1、微生物细胞大小测量、微生物细胞大小测量 1 1）目镜测微尺的校正：）目镜测微尺的校正： 将目镜测
6、微尺装入目镜将目镜测微尺装入目镜载物台上放镜台测微尺载物台上放镜台测微尺调节粗调节粗 调和细节调至直看到镜台测微尺的刻度调和细节调至直看到镜台测微尺的刻度 转动目镜，推转动目镜，推 动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合数出数出 两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数根据根据 两测微尺重合格数，计算出目镜测微尺每格实际长度两测微尺重合格数，计算出目镜测微尺每格实际长度 。 按上述步骤分别校正低倍镜、高倍镜和油镜的下目镜测尺每小格的实按上述步骤分别校正低倍镜、高倍镜和油镜的下目镜测尺每小格的实 际
7、长度。际长度。 四、操作步骤四、操作步骤 2 2）菌体大小的测量： ）菌体大小的测量： 取下镜台测微尺取下镜台测微尺 将待测标本片放在载物台上将待测标本片放在载物台上 观观 察标本片中细胞所占目镜测微尺的格数察标本片中细胞所占目镜测微尺的格数 根据目镜测根据目镜测 尺的实际长度算出细菌的大小尺的实际长度算出细菌的大小 操作要点：操作要点： 观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度。观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度。 换高倍镜和油镜校正时，防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏换高倍镜和油镜校正时，防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏 镜头。镜头。 四、操作步骤四、操作步骤 2 2、显
8、微直接计数、显微直接计数 1 1）血球计数室的观察和清洗）血球计数室的观察和清洗 取血球计数板置于载物台上取血球计数板置于载物台上 观察熟悉计数室的中观察熟悉计数室的中 方格和小方格方格和小方格 取下血球计数板取下血球计数板用自来水冲洗计用自来水冲洗计 数室后，再用无水乙醇将血球计数室冲洗干净数室后，再用无水乙醇将血球计数室冲洗干净 置置 干燥箱干燥干燥箱干燥 。 2 2）样品中酵母菌细胞的直接计数：）样品中酵母菌细胞的直接计数： 取干净血球计数板取干净血球计数板 在计数室上方盖上盖玻片在计数室上方盖上盖玻片 用无用无 菌吸管，吸取菌吸管，吸取摇匀摇匀的酵母菌稀释液的酵母菌稀释液 在盖玻片边缘
9、沾在盖玻片边缘沾 一下，让菌液沿缝隙一下，让菌液沿缝隙靠毛细管渗透靠毛细管渗透作用进入计数室作用进入计数室 静置静置5min 5min 低倍镜或高倍镜计算每个中方格内的细胞低倍镜或高倍镜计算每个中方格内的细胞 数数 完毕后完毕后清洗血细胞计数板清洗血细胞计数板 冲洗、干燥冲洗、干燥 计数规则：计数规则： 1 1）要求每小格内约有要求每小格内约有5 51010个菌体为宜；个菌体为宜； 2 2）选计数室四个角的中方格和中央的一个中方格进行计数；）选计数室四个角的中方格和中央的一个中方格进行计数； 3 3）当细胞位于方格的线上时，一般）当细胞位于方格的线上时，一般只数上方和右边线上的细胞 ； 4 4
10、）酵母出芽，又未脱离母体的，只有）酵母出芽，又未脱离母体的，只有当芽体大小达到母细胞的当芽体大小达到母细胞的 一半时，即作为两个菌体计算一半时，即作为两个菌体计算； 操作要点：操作要点： 血球计数室要清洁。血球计数室要清洁。 观察时光线不宜过强，否则难以找到计数室。观察时光线不宜过强，否则难以找到计数室。 吸取菌液前菌液要充分摇匀。吸取菌液前菌液要充分摇匀。 血球计数室充满菌液后，要静置血球计数室充满菌液后，要静置5min5min。 五、实验数据及处理结果五、实验数据及处理结果 1 1、大小测量、大小测量 1 1）将目镜测微尺校正结果填入下表：）将目镜测微尺校正结果填入下表： 接目镜放大倍数：
11、接目镜放大倍数： 2 2）将各菌测定结果填入下表）将各菌测定结果填入下表 接物镜接物镜接物镜倍数接物镜倍数目镜测微尺格数目镜测微尺格数镜台测微尺格数镜台测微尺格数目镜测微尺每格代表的长度目镜测微尺每格代表的长度 （m ） 低倍镜低倍镜 高倍镜高倍镜 油镜油镜 微生物类型微生物类型目镜测微目镜测微 尺每格代尺每格代 表的长度表的长度 （m ） 宽宽长长 菌体大小范菌体大小范 围（围（m ） 宽宽长长 目镜测微尺目镜测微尺 格数格数 宽度（宽度（m ） 目镜测微尺目镜测微尺 格数格数 长度（长度（m ） 杆菌杆菌 球菌球菌 螺旋菌螺旋菌 五、实验数据及处理结果五、实验数据及处理结果 2 2、显微计
12、数、显微计数 将结果记录于下表中，将结果记录于下表中，A A表示五个中方格的总菌数，表示五个中方格的总菌数，B B表示菌液稀释倍数表示菌液稀释倍数 。 各中方格菌数各中方格菌数 A A B B 二室平均值二室平均值菌数菌数/ml/ml 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 第一室第一室 第二室第二室 六、六、思考与讨论思考与讨论 1 1、根据你的体会，说明用血细胞计数板的误差主要、根据你的体会，说明用血细胞计数板的误差主要 来自哪些方面？应如何尽量减少误差、力求准确？来自哪些方面？应如何尽量减少误差、力求准确？ 2 2、某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，、某单位要求知道一种干酵母粉中
13、的活菌存活率， 请设计请设计1-21-2种可行的检测方法。种可行的检测方法。 下次实验项目：培养基的配制与高压蒸汽灭菌下次实验项目：培养基的配制与高压蒸汽灭菌 采用目镜测微尺测量经显微镜放大后的细胞物象，由于不采用目镜测微尺测量经显微镜放大后的细胞物象，由于不 同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺 每小格所代表的实际长度也不一样。因此在每小格所代表的实际长度也不一样。因此在测量前测量前要先对目镜要先对目镜 测微尺进行测微尺进行校正校正。 校正公式： 目镜测微尺每格长度(m)两重合线间镜台测微尺小格数10/ 两重合线间目镜测微尺小格数 10m10m 计数室计数室 16小方格 25中方格计数室 25小方格 16中方格计数室 计数室的刻度有两种规格： 计算公式： 25个中方格计算公式： 总菌液中的总菌数（个/ml）A/525104B 50000AB 16个中方格计算公式： 总菌液中的总菌数（个/ml） A/516104B 32000AB 式中：A为五个中方格的总菌数；B为菌液的稀释倍数；
