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1、下呼吸道感染细 菌学检验操作规范 临床通常将正常人喉以上部位称之为 上呼吸道，上呼吸道定植有大量的正常菌 群，而气管以下包括气管、支气管和肺泡 称下呼吸道，通常无菌。下呼吸道感染包 括急性气管-支气管炎、慢性支气管炎急 性发作、支气管扩张继发感染及肺实质感 染（肺炎、肺脓肿）等。病原体有细菌、 病毒、衣原体、支原体、真菌、立克次体 和原虫等。 社区获得性肺炎常见的病原菌有肺炎 链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌 、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌、军团菌、 肺炎支原体和肺炎衣原体等。医院获得性 肺炎常见的病原有铜绿假单胞菌、大肠埃 希菌、阴沟肠杆菌、克雷伯菌、鲍曼不动 杆菌、金黄色葡萄球菌和假丝酵母
2、菌等。 下呼吸道感染患者可有发热、咳嗽和 咳痰，痰呈脓性、粘稠或血性，可伴有胸 痛、气急，肺部闻及湿罗音、白细胞总数 及嗜中性粒细胞比例明显增高，X线检查 提示肺部有炎症性浸润或胸腔积液等体症 ，严重时可导致感染性休克和呼吸衰竭， 因此临床诊断一般不难；细菌学检验能明 确感染病原及药敏结果，有助于疾病治疗 、流行病学调查和医院感染的监测。临床 呼吸道标本中常见的分离细菌见表1。 表1 呼吸道标本中常见分离菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 草绿色链球菌、肺炎链球菌、 化脓性链球菌 表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌 、其他葡萄球菌 微球菌、消化链球菌、消化球菌 、肠球菌 真杆菌、丙酸杆菌、乳酸杆菌 放线菌、
3、奴卡菌、结核分枝杆 菌 白喉棒状杆菌、类白喉棒状杆菌 假丝酵母菌 韦荣球菌 脑膜炎奈瑟菌、其他奈瑟菌 卡他莫拉菌 肺炎克雷伯菌及其他克雷伯菌 沙雷菌、变形杆菌 大肠埃希菌及其他肠杆菌科细菌 百日咳鲍特菌、不动杆菌 铜绿 假单胞菌及其他假单胞菌属细菌 、嗜肺军团 菌、气单胞菌、流感嗜血 杆菌、副流杆嗜血杆菌、梭杆菌 一、送检指征 痰液标本是临床微生物学检验最常见 的的标本，但不是下呼吸道感染的最佳标 本。 1.咳嗽 咳嗽咳痰是下呼吸道感染最 常见的症状，咳嗽的性质与痰的性状如脓 或铁锈样痰具有鉴别诊断意义。 2.咯血 喉以下的呼吸道出血为咯血 ，包括泡沫血痰、鲜血和痰中带血等。 一、送检指征 3
4、.呼吸困难 呼吸急促或哮喘，常 伴有胸痛。 4.发热伴白细胞增高尤其是中性粒 细胞或CRP明显增高。 5.胸部影像学检查提示有感染可能 。 二、标本采集与验收 对可疑烈性呼吸道传染病（如 SARS、肺炭疽、肺鼠疫等）的患者采 集检验标本时必须注意生物安全防护。 （一）标本采集方法 1.自然咳痰法 以晨痰为佳，采集标本 前应用清水、冷开水漱口或用牙刷清洁口腔 和牙齿，有假牙者应取下假牙。尽可能在用 抗菌药物之前采集标本。用力咳出呼吸道深 部的痰，痰液直接吐入无菌、清洁、干燥、 不渗漏、不吸水的广口带盖的容器中，标本 量应1ml。咳痰困难者可用雾化吸入加温至 45C的100g/L NaCl水溶液，
5、使痰液易于排出 。对难于自然咳痰患者可用无菌吸痰管抽取 气管深部分泌物。标本应尽快送检，不能及 时送检的标本，室温保存2h。 （一）标本采集方法 2.支气管镜采集法、防污染毛刷采 集法、环甲膜穿刺经气管吸引法、经胸 壁针穿刺吸引法和支气管肺泡灌洗法， 均由临床医生按相应操作规程采集，但 必须注意采集标本时尽可能避免咽喉部 正常菌群的污染。 （一）标本采集方法 3.小儿取痰法 用弯压舌板向后 压舌，将拭子伸入咽部，小儿经压舌 刺激咳痰时，可喷出肺部或气管分泌 物粘在拭子上送检。幼儿还可用手指 轻叩胸骨柄上方，以诱发咳痰。 （二）标本验收与拒收 遇有不合格标本应及时与临床联系，反 馈不合格标本拒收
6、的具体理由。 下呼吸道细菌学检验标本验收与拒收见 下： 1.呼吸道有大量的正常菌群存在，咽拭 子、咳痰、吸出的分泌物厌氧菌培养无意义 。 （二）标本验收与拒收 2.申请单填写应完整无误。标本标识必须 唯一，并与申请单相符，未标采集时间、部 位或检验要求等拒收。 3.痰标本呈水样或唾液样，拒收。 4.涂片白细胞和鳞状上皮细胞计数：白细 胞10低倍镜和鳞状上皮细胞25低倍 镜，表示该标本已污染正常菌群，建议重送 标本。 （二）标本验收与拒收 5.标本容器必需符合规定，溢漏、无盖者 拒收。 6.送检时间超过2h拒收。 7.同时同部位或同一天两份相同检测的标 本，应与申请医生协商处理。 三、实验室检查
7、 （一）肉眼观察 观察痰液的颜色 、粘度、有无血丝和是否呈脓性，如见 有颗粒存在，则应注意可能与放线菌属 及奴卡菌属感染有关。 （二）显微镜检查 下呼吸道细 菌学检验的标本均需涂片革兰染色进 行常规的白细胞和鳞状上皮细胞显微 镜下计数和细菌学检查，其目的是判 别送检的标本是否合适做细菌培养， 并初步判定有否病原菌、病原菌的数 量及其类别，有助于初步报告、选择 培养基和对培养结果的综合分析。 推荐判别标本合格的标准见表2。 表2 下呼吸道细菌学检验标本涂片显微镜白细 胞和鳞状上皮细胞计数判断标准 分类 细胞数低倍镜 结果判断 白细胞 鳞状上皮细胞 A25 25 1025 尚合格可用于 细菌培养
8、C25 不合格，重送 标本 近年来推荐判别标本合格的简单方法 是痰标本涂片镜检10个白细胞低倍镜 ，就可判断是基本合格并可用于细菌培养 的标本，尤其是白细胞减少的患者。 油镜下观察细菌形态、排列和染色特 性，可初步推定菌属（或种），涂片中所 见细菌的量及吞噬细胞内是否有细菌等， 如发现酵母样菌孢子、菌丝或放线菌、奴 卡菌等，应予相应报告和继续检查。 （三）分离培养 痰标本培养前处理 不含或含粘液很 少的合格标本，可直接接种，遇有含大量 粘液的标本，应加入等量的液化剂（如 pH7.6的10g/L胰酶溶液等），放置35C待 充分液化再行接种。也可加液化剂后用旋 转混匀器搅拌混匀，3000r/min
9、离心10min ，弃去上清液，取沉淀物接种。 一般细菌培养 (1)一般细菌培养应同时划区接种： 1)血平板 适用于分离肺炎链球菌和其他 细菌。 2)加抗生素的巧克力平板 适用于分离嗜 血杆菌。 3)麦康凯中国蓝平板 适用于分离革兰 阴性杆菌。 (2)分离培养 血平板和巧克力平板 需置5%CO2环境，麦康凯平板中 国蓝平板，35C需氧孵育。 (3)挑取可疑菌落进行细菌鉴定和药敏试验，痰 及下呼吸道分泌物标本易受到上呼吸道正常菌 群的污染，临床微生物实验室通常可从送检的 呼吸道标本中分离出多种细菌，但分离的细菌 是否能真正代表下呼吸道感染的病原菌，这对 临床诊断和治疗感染性疾病至关重要。实验室 人
10、员在检验过程中应重视判断所分离的细菌是 污染的上呼吸道正常菌群还是引起下呼吸道感 染的病原菌。在实际工作中，有时也由于细菌 生长速度不一，如肺炎链球菌可能被生长速度 快的细菌（包括正常菌群）菌落掩盖，不仔细 观察就会漏检。 当在同一培养基上分离出多种病原菌时， 应主动与临床医生联系，结合患者的临床症状 、痰涂片染色镜检及近期细菌培养结果（如近 期同一病人多次分离培养出同一种菌）等综合 判断所分离的多种细菌中哪一种菌可能为优势 病原菌。当分离的优势菌与涂片染色镜检结果 相符时，优势菌必需进行药敏试验。若分离培 养结果与涂片染色镜检结果不相符时，或少量 生长优势可疑病原菌时，也需做药敏试验，但 在
11、报告中提示，此结果请结合临床和涂片所见 进行分析。痰及下呼吸道分泌物标本检验流程 见下图。 痰及下呼吸道标本细菌学检验操作流程 痰及下呼吸道分泌物标本 肉眼观察及涂片革兰染色白细胞、鳞状上皮细胞和细菌学显微镜检查 合格标本 培养前处理 血平板 （5%CO2环境） 巧克力平板 （5%CO2环境） 麦康凯平板 （需氧环境） 初步报告 不合格标本 拒收及建议重新 采集合格标本 菌落观察，涂片染色镜检 结合涂片白细胞、鳞状上皮细胞计数和细菌学镜检结果与培养结果综合分析 菌种鉴定 药敏试验 结合涂片白细胞、鳞状上皮细胞计数和细菌学镜检与培养鉴定、药敏结果综合分析 结果报告（最终报告） 四、结果报告 由于
12、检验结果报告的时效性，下呼吸道标 本细菌学检验结果分为初步报告和最终报告。 1.初步报告 应包括标本涂片革兰染色白 细胞和鳞状上皮细胞计数、细菌学镜检的描述 性报告（发现有诊断价值时应及时向临床口头 报告，并作相关记录）。 1)涂片革兰染色白细胞和鳞状上皮细胞计数、 细菌学镜检的描述性报告 细菌学镜检的描述性报告：如镜检见到排 列成葡萄状的革兰阳性球菌，可报告“找到革兰 阳性球菌，形似葡萄球菌”；如见到瓜子仁形成 矛头状端相背，成双排列，具有明显荚膜的革 兰阳性球菌时，可报告“找到革兰阳性球菌，形 似肺炎链球菌”；如见到不易识别的细菌时则报 告“找到革兰性形细菌”；如发现其他有意 义病原微生物
13、存在时，应主动描述性报告观察 结果，并与临床联系和追踪进一步检查。 2) 白细胞和鳞状上皮细胞计数的描述性报 告：包括白细胞和鳞状上皮细胞数低倍 、细胞内是否含有细菌和胞内细菌染色及 形态学特点。 2.最终结果 报告应包括送检标本肉眼观 察的结果、涂片革兰染色白细胞和鳞状上 皮细胞计数、细菌学镜检的描述性报告、 分离致病菌的鉴定结果、药敏试验结果。 1)痰标本涂片革兰染色后白细胞和鳞状上皮细 胞计数、细菌学镜检未发现有临床诊断意义结 果（可不用初步报告），细菌分离培养为正常 菌群时，最终检验结果应报告“正常菌群生长” 。若无菌生长应报告“经48h培养无细菌生长” 。有意义的培养基（巧克力平板、
14、血平板）， 再置2天仍无可疑病原菌生长时可将其弃之； 但对偶然分离的“优势可疑病原菌”，还需做药 敏试验，并及时与临床联系，最终检验报告应 包括标本肉眼观察结果、涂片革兰染色白细胞 和鳞状上皮细胞计数及细菌学镜检的描述性报 告、细菌鉴定的规范细菌名称和药敏试验结果 。但应提示所报告的结果请结合临床进行分析 。 2)标本涂片革兰染色白细胞和鳞状上皮细胞计 数、细菌学镜检发现有诊断价值时，细菌分 离培养检出优势菌，并与涂片染色镜检结果 相符时，除及时初步报告外，最终检验结果 应报告肉眼观察的结果、涂片革兰染色白细 胞和鳞状上皮细胞计数、细菌学镜检的描述 性报告、优势菌鉴定的规范细菌名称和药敏 试验结果等；细菌分离培养未检出优势菌， 通常提示可能厌氧菌感染、大量应用抗菌药 物、培养基及培养方法或送检标本保存和运 送不当等原因。
