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1、 1 * 生物大分子分离纯化 原理与技术 2 * 内容提要 1、层析原理与技术 2、凝胶过滤层析 3、UNOsphere离子交换分离技术 4、CHT陶瓷羟基磷灰石分离技术 5、疏水相互作用与亲和层析 3 * Life is based on proteins and their interactions 4 * 层析原理与操作层析原理与操作 5 * 层析的起源和原理 起源-1906年，俄国植物学家Tsweet 原理-利用物质分配系数不同达到分离 目的 原理与操作 Chromatography 层析 色谱 6 * 什么是生物层析 根据生物分子物理化学特性的不同而达到分离 极性：polarity
2、(solubility, volatility) HIC, RP 离子特性：ionic characteristics (charge) IEX 大小与形状：size/mass (diffusion, sedimentation) GF 结构特征与活性位点：shape (ligand binding, affinity) AC 这些特性的区别使不同蛋白质分子在层析的固定相和流动相的分配不同而 达到分离 原理与操作 7 * Gel Filtration 凝胶过滤 Ion Exchange 离子交换 Hydrophobic Interaction 疏水层析 反相 Affinity 亲和层析 CHT
3、 羟基磷灰石 原理与操作 8 * 最广泛的蛋白质分离纯化方法 条件温和 维持蛋白质空间结构与活性 基于蛋白质对固定相的不同保留达到分离 蛋白质溶于流动相中，经过装填固定相的柱子分离 层析原理与操作 9 * 层析的5个操作步骤 装柱并平衡 上样 平衡 洗脱 再生 上样 装填有层析介 质的层析柱 分离 分离组分流出 原理与操作 10 * 层析图 原理与操作 第一峰, 外水体积, Vo, 不与柱中填料相互作用直接从柱中 流出。这是样品中的未结合物质 VoVeVt 蛋白质含量 (A280), 由 UV检测器读出，y轴 基线 洗脱峰，有些可以很好的分离， 有些分得不是很好，有部分交叉 有时这里也显示梯
4、度浓度等检测值 时间或体积，x轴 11 * 纯化平台的硬件结构 层析工作站 层析介质和层析柱 原理与操作 12 * 层析系统 DuoFlow中高压层析系统 LP低压层析系统 Profinia全自动亲和 层析系统 手动层析组件 13 * DuoFlow中高压层析系统 主要特点： 1. 3500psi高压力下梯度模式 最大流速可达20ml/min 2. 连续波长，4波长同步检测 3. 方形X、Y轴组分收集器 4. 软件直观容易使用 14 * BioLogic LP 低压层析系统 LP Data View 软件 BioLogic LP 系统 BioFrac 方形 组分收集器 主要特点： 1. 流速精
5、确，0.01ml/min 2. 检测灵敏度更高, 0.001AU 3. 兼容方形收集器 15 * Profinia 蛋白质纯化系统 主要特点： 1. 全自动亲和纯化，包括亲和标签 、亲和无标签，抗体等纯化 2. 双紫外检测器设计 3. 纯化与脱盐串联一步完成 4. 结果直接报告目标蛋白的浓度和 得率 16 * 为什么在层析技术中要使用层析仪 介质的要求 实验的精密度和重现性要 求 时间的要求 17 * 纯化平台的硬件结构 层析介质与层析柱，原理与技术 18 * 层析介质 离子交换层析介质 Unosphere Q，S MacroPrep High Q,High S,DEAE,CM 亲和层析 Pr
6、ofinity IMAC金属螯合介质 Profinity Epoxide环氧亲和介质 Affi-Gel Protein A, Affi-Prep Protein A Affi-Gel蓝胶，DEAE蓝胶，CM蓝胶 Affi-Prep多粘菌素介质 Affi-Gel硼胶 Affi-Gel配体固定化活化介质 凝胶过滤层析介质 Bio-Gel P系列 Bio-Beads S-X介质 羟基磷灰石介质（CHT） 氟代羟基磷灰石介质（CFT） 疏水层析介质 Macro-Prep Methyl HIC Macro-Prep t-Butyl HIC Bio-Beads SM-2吸附剂 19 * 层析柱 分析柱 离
7、子交换分析柱：Uno Q, S Aminex分析柱分析单糖、寡糖、有机酸、有机碱，以及肽和核酸有机小分子 羟基磷灰石分析柱：Bio-Scale CHT-I 凝胶过滤分析柱：Bio-Sil, Bio-Silect HPLC 分析柱 反相层析分析柱：Hi-Pore RP304, Hi-Pore RP318 各种层析介质的Cartridges用于条件摸索 UNOsphere MacroPrep CHT HIC 20 * 层析介质结构原理 Unosphere MacroPrep 离子交换层析 Q，S，DEAE，CM 疏水层析 -CH3, t-Butyl 亲和层析 Protein A IDANi 多粘菌
8、素 凝胶过滤 CHT和CFT Unosphere Q, S MacroPrep High Q, S MacroPrep DEAE, CM MacroPrep Methyl HIC MacroPrep t-Butyl HIC Profinity IMAC Profinity Epoxide Affi-Gel Protein A, Affi-Prep Protein A Affi-Gel, DEAE, CM Affi-Prep Polymixin Affi-Gel硼胶 Affi-Gel配体固定化活化 21 * 层析介质及其技术层析介质及其技术 凝胶过滤层析 离子交换层析 羟基磷灰石层析 疏水层析
9、亲和层析 22 * 1. Spherical particles packed into a column 2. Sample applied3. Buffer mobile phase and sample move through column, molecules diffuse in and out of matrix 4. large molecules leave the column first followed by smaller molecules in order of size, molecules larger than the matrix pores pass s
10、traight through. Diffusion Buffer Diffusion into the pores Diffusion out of the pores Buffer 凝胶过滤 23 * 凝胶过滤层析 分离纯化原理 24 * A good gel for gel filtration contains about 95% water 凝胶结构 25 * Steric exclusion leads to early elution 按照分子量大小洗脱 大分子首先洗脱，最小的分子在最后面洗脱 26 * 100 1,000 10,000 100,000 Bio-Gel P2 Bi
11、o-Gel P4 Bio-Gel P6 Bio-Gel P10 Bio-Gel P30 Bio-Gel P60 Bio-Gel P100 1,800 8004,000 1,0006,000，用于脱盐 1,50020,000 2,50040,000 3,00060,000 5,000100,000 100 凝胶过滤层析 凝胶的选择 27 * Bio-Gel P4(800-4,000) for separation digested products from IgG 凝胶过滤层析 凝胶的选择 28 * 凝胶过滤层析 Bio-Gel P6(1000-6000) 凝胶的选择 29 * 凝胶过滤层析
12、Bio-Gel P10(1500-20,000) 凝胶的选择 30 * 凝胶过滤层析 Bio-Scale Mini Bio-Gel P6脱盐预装柱 操作方便，可连接在DuoFlow、LP、 Profinia和Econo泵上 31 * Bio-Beads S-X介质 多孔的聚苯乙烯二乙烯微球体 Bio-Beads S-X1 Bio-Beads S-X3 600 Bio-Beads S-X8 1,000 Bio-Beads S-X12400 高分辨率亲脂性分子排阻色谱 2,000 14,000 中草药和天然产物活性成分分离纯化 高分辨率，快速纯化酯类、芳香族，多环 、杂环化合物 介质可兼容苯、甲苯
13、、二甲 苯、四氯化碳、二甲基甲酰 胺、酮、二氯甲烷、二氯代 苯、全氯乙烯等有机溶剂 凝胶过滤层析 32 * 1、三硬脂酸甘油酯，891 2、三肉豆蔻酸甘油酯，729 3、三月桂酸甘油酯，645 4、三辛酸甘油酯，477 5、三己酸甘油酯，393 6、十六烷，226 7、十一烷，156 Bio-Beads S-X8 分离效果 高分辨率亲脂性分子排阻色谱Bio-Beads S-X介质 凝胶过滤层析 33 * 柱长的选择 分离：30120cm 脱盐：30cm以下 洗脱液 离子强度 低高 离子作用 排阻作用（0.1-0.5M) 疏水作用 pH中性 流速，根据层析介质的说明，一般很低 样品容量：13CV
14、 凝胶过滤层析 操作参数选择 34 * 增加分辨率的方法 检测柱效 检测分离度 减少上样体积 降低流速 使用更小的介质颗粒的介质 连接2根层析柱 35 * 1.可分离相对分子量从几百到几十万的物质 具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的蛋白质完 全分开,6000个理论塔板的可将分子量相差1.5倍的蛋白质完全分开; 建议柱高在80-120cm,直径=H/30 2.脱盐 凝胶过滤层析 凝胶过滤层析的应用 36 * 凝胶过滤层析 凝胶过滤层析的特点： 1. 层析柱规模很大，实验室1.0-2.530-100cm，工艺1020200cm，从 而设备成本很高； 2. 上样体积少，必须少于柱床体积的3才能达到较好的分离效果，如果 大体积样品必须浓缩，从而造成样品的损失和增大工艺的复杂性； 3. 工艺时间（生产周期）长，甚至24小时或以上； 4. 分辨率低； 5. 不需摸索纯化条件，按照分子量区带分离 因此，往往用分子筛分离时只适用于纯化的最后一步去热原，或离子 交换上样前的脱盐 37 * cation weakstrong anion weakstrong DEAE Diethylamino- ethyl Q Quaternary
