基因芯片研究报告理论方法

《基因芯片研究报告理论方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因芯片研究报告理论方法（72页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、单击此处编辑母版标题样式 单击此处编辑母版副标题样式 *1 基因芯片分析的理论与方法 nericexist163. com nQQ:7049971 基因芯片概论 基因芯片分析的概念 n基因芯片(Gene chip)技术是指通过微阵 列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列 通过高速机器人或原位合成方式以一定的 顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固 相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱 基互补杂交原理，进行大量的基因表达及 监测等方面研究的技术。 基因芯片分析的优点 n快速 n高通量(104 - 106) n自动化 n使用的试剂少 n低成本 基因芯片分析的应用范围 nAcademi

2、c research of genetic diseases nCancer nPrenatal genetics（产前遗传学研究 ） nGeneral genetic diseases nInfectious diseases nDrug discovery nAnimal farming/veterinary nIndustrial (fermentation) nEnvironmental 发展的方向:从多角度研究揭示生命现象 nStages: developmental,transformation, time fter treatment, etc. nTreatments (sti

3、muli, drugs, nutrients, etc.) nPhysiological states (stressed, fasting, etc.) nTissue distribution n(position, 3D) 基因芯片的发展是推动系统生物学发展的动力 利用基因芯片研究生命现象的测略 nFactors involved = Components nOrder of events = Pathways nInteractions = Circuit KEGG GO 基因芯片的分类 根据用途分类根据用途分类 gene expression patterngene expressi

4、on pattern BiologicalBiological SampleSample FunctionalFunctional InformationInformation 基因芯片的分类 nOligonucleotide array n Synthesized on a chip（ Affymetrix） n Spot on a solid matrix（ Compugen） ncDNA array（ Incyte ） 根据探针类型分类根据探针类型分类 expressionexpressiongenomic analysisgenomic analysis cDNA-ChipcDNA-C

5、hip Genomic Chip Genomic Chip 50,000 n 50,000 n 一些发展中的基因芯片技术平台 n利用生物分子的电物理特性进行基因表达监测：监 测速度很快，适用于基因表大，蛋白质组及基因型 的研究 n利用电场原理进行高密度芯片生产：基于适合用于 生物学的集成电路，集成电路包含可以独立寻址的 微电极阵列，结合特殊的液体流动系统，可以使大 部分生物分子按照来自于计算机的数字指令运动。 n喷墨点样技术：以高度定位的形式把合成好的寡核 苷酸分子喷点倒玻璃表面。 n寡核苷酸包被的微珠芯片 n平行信号测序技术：对基因表达进行定量分析 基因芯片分析 试验方法 基因芯片分析的主要

6、步骤 cDNA基因芯片分析的主要步骤 cDNA芯片分析的主要步骤 nSpot by Array spotter cDNA芯片分析的主要步骤 Hybridizing by Automatic hybridization processor cDNA芯片分析的主要步骤 nLaser scanner Oligonucleotide array （GeneChip） L L L L L L L L L L L L L L L L cDNAcDNA AAAAAAAA 总RNA的制备 反转录 体外 转录 生物素标记的cRNA 片段化处理 带标记的cRNA片断 35-200 bases 0.5-2 ug/u

7、l 起始用量5-10ug （IVT） 操作流程（以真核生物为例 ） L L L L L L L L L L 标记的cRNA片断杂交混合液的制备 Eukaryotic Hyb.Control Control Oligo B2 杂交 （16hour ） 数据分析 扫 描 洗脱 染色 Oligonucleotide array 的特点 1 个平方厘米的面积至少可排列 四十多万个探针合成区（“点” ） 基因2 基因1cDNA 基因2cDNA 用于cDNA 芯片的探针 Oligo probe基因1 多个检测结果可以参考 Oligonucleotide array 的优越性 序列准确性高 原位合成 PCR

8、扩增,点样 起始Total RNA 110ug 50ug 均一的退火温度 25mer 300bp3Kb 特异性更高 多段探针 单个探针 非特异性杂交 2 30 cDNA 芯片Affy 芯片优 势 芯片分析数据的标准化 nQuantitation ndata-quality assessments n背景处理：图像上各点的吸光度值包含了样品和 背景信号，在提取数据前必须将背景扣除 n杂交点质量：由于点样或膜变形等原因目前较多 的软件对杂交点的识别定位仍需要人为的调整 n数据的标准化：其目的是避免基因芯片实验中因 系统差异造成芯片间数据比较的困难。最常用的 是“看家基因”法，它预先选择一组表达水平

9、不 变的看家基因，计算出这组基因平均ratio 值为1 时的标准化系数，然后将其应用于全部的数据以 达到标准化的目的 (A)Scatter plots for a Cy5-liver/Cy3-liver control hubridization A (B)Cy5-ovarian tumor/Cy3-normal ovary hubridization (C)The value of Cy3 and Cy5 hydridization signals from each clone were plotted directly onto the plot （卵巢癌） Data Analysis

10、- Reveal the Difference 基因芯片数据分析 和信息挖掘方法 一. 聚类分析 聚类分析 n聚类分析是模式识别中一种非常有吸引力 的方法，特别适用于模式分类数不知道的 情况。 n从机器学习的角度来看，有两种基本的聚 类分析： n有教师聚类 n无教师聚类 n基因表达数据聚类分析一般包括以下几个 步骤： n（）确定基因表达的数据 n（）计算相似性矩阵，各个矩阵元素代表两 个基因的表达是否相似 n（）选择算法进行聚类分析 n（）显示分析结果。 n对数据进行聚类分析之前，必须将包含在基因表 达矩阵中的数据进行相似程度分析，并且对分析 结果进行量化。 n通常情况下，相似往往被赋于一个较

11、大的量化的 值，而不相似则由一个较小的量化的值来表示。 n在实际计算中，往往以距离代替相似的概念，相 似性度量被转化为两个基因表达模式之间的距离 。距离越小，表达模式越相近，反之，则表达模 式差异大。 两个表达模式之间的关系 (a) 相似 (b) 变化趋势一致 (c) 两个基因的调控结果不一样或甚至相反 聚类分析的目的 n可诱导基因是共表达的 n许多构成性表达的基因不受调 节 n根据表达相似形排列基因 n功能相似的基因被聚为不同的 类 n可以揭示细胞的生理状态 n可以帮助研究未知基因的功能 聚类结果显示: Cluster, Cluster viewer 二. 基因调控网络分析 2.1 基 本

12、理 论 定义 n一个基因网络(pathway)由一组生物分子（如基 因、蛋白质）以及它们之间的相互作用构成，这 些生物分子共同完成一些特定的细胞功能任务 n在实际分析过程中，往往以图这种数据结构表示 基因网络，图中的节点代表基因或者蛋白质，而 节点之间的连线代表基因、蛋白质之间的相互作 用。基因网络描述了特定细胞或组织中的功能路 径，如代谢、基因调控，信号传导等。 原理 n基因表达实际上是细胞、组织、器官受遗传和环 境影响的结果。 n一个基因的转录和表达由细胞的生化状态所决定 ，在一个基因的转录过程中，一组转录因子作用 于该基因的启动子区域，控制该基因转录，而这 些转录因子本身又是其它基因的产

13、物。 n当一个基因通过转录、翻译形成功能基因产物后 ，它将改变细胞的生化状态，从而直接或间接地 影响其它基因的表达，甚至影响自身的表达。多 个基因的表达不断变化，使得细胞的生化状态不 断地变化。 n一个基因的表达受其它基因的影响，而这 个基因又会影响其它基因的表达，这种相 互影响、相互制约关系构成了复杂的基因 表达调控网络。 n基因表达数据之中隐含基因之间的相互作 用关系，因而可以通过分析基因表达数据 ，构建基因调控网络 应用 nBetter understand the physiology of the organism nPredict the effect of a drug Pred

14、ict the weaknesses or side effects of a drug nPredict good or bad drug combinations nUnderstand disease processes nGene function assignment nMake a “perfect” simulation of cellular nfunction to use as an experimental model nMany tools “feed” into this understanding including microarrays 2.2 pathway

15、数据库介绍 Pathway 数据库 nGO nKEGG nGENMAPP nBIACARTA nGeneNet n细胞因子网络数据库 n自由基信号数据库 关于GO nGO(gene ontology)是基因本体论联合会(Gene Ontology Consortium)所建立的数据库，旨在建立一 个适用于各种物种的，对基因和蛋白功能进行限定和 描述的，并随着研究的不断深入而更新的语言词汇标 准。GO是多种生物学本体论语言中的一种，提供了三 层结构的系统定义方式，用于描述基因产物的功能。 nGO可以被用来在小鼠基因组中查询和信号转导相关的 基因产物 nGO发展了具有三级结构的标准语言（ontol

16、ogies） 。根据基因产物的相关分子功能，生物学途径 ，细胞学组件而给予定义，无物种相关性。 关于KEGG nKEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) （京都大学基因和基因组百科全 书数据库） nKEGG 是系统分析基因功能的数据库 ，将基因组的信息与基因功能联系起 来，旨在揭示生命现象的遗传与化学 蓝图 数据库 KEGG PATHWAY Database KEGG GENES Database KEGG LIGAND Database 用途 搜寻pathway, 产 生可能的反应路径 搜寻类似的基因序 列搜寻类似的基因 组序列 搜寻类似的复合物 结构,类似的多糖结 构及类似的反应 类别 通路信息 基因组信息 化学信息 nKEGG中的通路分为五大类： 1 新陈代谢通路 2 遗传信息处理通路 3 环境信息处理通路 4 细胞内通路 5 人类病症相关通路 nPATHWAY提供所选定通路的参考资料、涉及的反