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1、第五章高效液相色谱法HPCL目录一、概述二、基本原理三、装置四、分类五、在农药分析中的应用基本要求:1.了解高效液相色谱法的发展历程2.掌握高效液相色谱的基本原理，柱效影响因素3.了解高效液相色谱法的流程，熟悉高效液相色谱法装置4.掌握高效液相色谱法的分类5.理解高效液相色谱法在农药分析中的应用一、概述以液体作流动相，液体或固体作固定相的分离分析技术称为液相色谱法。经典的柱色谱法是用碳酸钙或氯化铝等吸附剂填充于玻璃柱管内，吸附剂粒径大于l00m，柱的装填不紧密不均匀，分离效率不高；流动相由柱管上端依靠重力向下过柱，分离速度慢；各组分依次被淋洗下来，进行测定，效率很低，分析速度很慢。20世纪40
2、年代出现了薄层色谱法，操作方便，分析速度加快，但重复性差，难以定量。60年代初吉丁斯(J.C.Giddings)将气相色谱理论修正后用于液相色谱，为其现代化奠定了理论基础。以后在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自动化；这种色谱技术称为高效液相色谱法。1.1HPLC与经典柱色谱法相比，具有以下特点：1高压为了使流动相能迅速地通过色谱柱，必须施加高压2高速使用无脉动的高压泵、流动相的流速一船为110mlmin3高效使用颗粒均匀的新型细粒固定相，提高了分离效率，有时一根柱子可同时分离100种以上的组分。4高灵敏度应用各种高灵敏度的检测器，可测定微量组
3、分。使用紫外检测器，最小检测量可达1109g。5高度自动化利用微处理机控制色谱操作条件和处理色谱数据，实现了高度自动化。6流出组分容易收集1.2HPLC与GC的差别(1)应用领域不同：在已知的化合物中，只有20可用GC测定，而HPLC可检测的对象占有机物总数的80一85；GC局限于易挥发和热稳定农药的分离和分析；HPLC可分离和分折不挥发的、热稳定性差的以及离子型的农药。(2)GC的分离是基于混合组分在固定液中的溶解度不同，使用的流动相通常是惰性气体。GC主要是通过改变固定相和改变柱温来改善分离效果。HPLC的流动相为液体，它对样本具有一定溶解性能，除了运载样本组分通过色谱住和进入检测器外，还
4、参与色谱分离过程；在液相色谱中除通过改变固定相改善分离效果外，通常用改变流动相组成来改善分离(3)HPLC的柱温受流动相沸点的限制，通常在室温或略高于室温的条件下测定，分离时温度较低是它的优点，能保留农药的原来分子，可制备农药标准品。(4)农药分子在液体中的扩散系数比在气体中小45个数量级，所以在HPLC中必须特别注意柱外效应对分离的不良影响。(5)液体的粘度比气体的粘度大23个数量级，所以HPLC的柱长通常不超过30cm，而GC可采用长柱(6)液体是不可压缩的，而气体可被压缩，因此在GC中与载气体积有关的参数都必须进行校正。二、基本原理高效液相色谱的基本理论是在经典液相色谱的基础上，引入了气
5、相色谱的理论，加以改进而发展的。使用液相色谱的最终目的是：使样本在最短时间内获得最好的分离和分析。2.1.1选择性(分离因子)色谱柱的选择性是衡量二个化合物能否分离的指标，亦称分离因子。它是两个组分净保留时间的比(即相对保留值)或两个组分的平衡分配之比。V保留体积；t保留时间；W为峰宽；H为峰高根据图51的两个峰，选择性可用下式表示：（51）t0为溶剂保留时间，t1和t2为峰1和峰2的保留时间，式中k1和k2是农药1和2的分配系数。（52）2.1.2容量因子某一特定化合物在色谱柱上的容量因子是衡量该柱对此化合物的保留特性，化合物的净保留时间与非滞留时间之比，根据图51，峰1的容量因子为：（53
6、）2.1.3柱效柱效是衡量某一特定色谱柱对化合物的谱带展宽度和改善分离的能力，理论塔板数(N)可用下式表示：根据上式，理论塔板数随t成正比地增大，洗脱的谱带宽度增加，理论塔板数下降。因半峰宽易测量准确，计算的N值也比较准确。实际计算时，使用理论塔板的相当高度HETP（或H）较方便，它也是柱效率的量度。L为柱的长度，H小则N大，即柱效高。5-45-55-62.1.4分离度相邻两个峰的分离程度称为分离度R。两个峰尖之间距离越大，分离度越大；两峰越宽则分离度越低。分离度R按下式计算：（57）按式(5-7)很容易比较两化合物分离效果的好坏，但此式不能指导如何改进实验设计，以达到更有效的分离。考虑与实验
7、技术有关的参数来表示分离度，假定相邻两峰的峰宽相等可导出分离度与前述三个基本色谱参数的关系：（58）A：式中(1)项a是选择性或分离因子。al，无论柱的理论塔板数有多大，分离度R等于0。B：式中(2)项K是容量因子，可通过改变溶剂强度来改变。强溶剂出峰时间短，导致小的K值，弱溶剂给出较大的K值，分离度高，但峰变宽；C：式中(3)项N是理论塔板数，可由改变色谱柱的长度，颗粒的大小，增减流动相的速度而变动。柱长和保留时间成正比。（a）分离不良，两峰距离太近；（b）加大a值后，提高了选择性，两峰分开；(c)在a的基础上，加大N提高柱效，使峰变窄，峰尖位置不变，但两峰可以分离；(d)增大K值，分离度好
8、，但保留时间延长，峰拖尾后谱带变宽。因此，利用式(5-8)使给定的分离最佳化时，首先调整K值，使K在2-5之间，谱带不太宽，分离的时间亦合适，其次选择N，以提高柱效，三、装置高效液相色谱仪的设计与所采用的分离原理无关，可以购买完整的器，亦可以购买单独的部件组装成适用的仪器。典型的液相色谱仪由以下部件组成：1.高压输液系统（贮液器、输液泵、梯度淋洗装置）2.进样系统（进样器）3.分离系统（色谱柱）4.检测系统（检测器）5.数据处理系统（记录仪和积分仪）流程见图5-43.1.高压输液系统3.1.1贮液容器某些商品贮液器配备有流动相脱气的装置，装有加热器，温度调节器和磁力搅拌器。流动相的脱气是非常重
9、要的，因为溶剂中溶解的空气在低压部件如检测器里会逸出气泡来，气泡的出现会使检测器的噪声加大。常用的除气方法有三种：1)加热法2)抽真空法3)超声波处理可在贮液容器中充满氮气或氦气防止某种溶剂被氧化3.1.2高压输液泵主要部件之一，压力：150350105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性3.1.3梯度洗脱气相色谱分析是为了改善分离和缩短分析周期，采用程序升温控制；而在液相色谱中，使用梯度洗脱。所谓梯度洗脱是在一个色谱分析周期里不断改变流动相的化
10、学组分，使一些复杂混合物的分析能做到：1)提高分辨能力；2)峰形得到改善；3)缩短分析周期。3.2进样系统进样系统包括取样、进样两个功能，手动自动两种方式，把样品引进色谱柱的方法有：进样器进样、阀进样、自动进样器。进样过程往往会影响分离效果，当注入样品后，由扩散而导致峰形展宽；而在高压状态下进样，难度较大；还要求进样时不影响输液系统的压力和流速，也不出现漏液等现象。3.3色谱分离系统色谱柱是高效液谱仪的心脏部分。柱内填充填料的种类不同，性能也不同，通常采用不锈钢直形住，内径为2-4mm，长度为15-30cm，柱子加长能改善分离，但要提高柱入口处的压力，且加长分析时间。经典的液相色谱填充剂：1)
11、颗粒大，直径一般在l00m以上；2)粒度不均匀，3)没有一定形状；4)经不住高压。高效液柏色谱填充剂：1)颗粒小，直径为10一30m，最小为35m；2)粒度均匀；3)一般为球形；4)能在高压下工作。样品中如有吸附性的组分，会影响色谱柱的使用寿命，除了应在进色谱柱前抽提或过滤外，最简单的办法是在分析柱前连接一根3-5cm长的保护柱，内装与色谱柱性能相同的填料，使用0.2m的过滤片，放在进样器和分析柱之间。保护柱可防止来自流动相和样品中的不溶性微粒对色谱挂的堵塞，还可避免硅胶或键合相的流失，可维护柱效，保护柱并不能无限止地吸附杂质，使用时应观察检测器讯号，如有基线漂移、怪峰或柱压增加等现象，说明保
12、护柱已被污染，应更换填料。3.4检测系统（检测器）检测器是用于连续检测柱流出物中不同组分及其含量的部件，主要用于监测经色谱柱分离后的组分浓度的变化，并由数据处理系统绘出图谱来进行定性和定量分析。3.4.1理想的液相色谱监测器应具备如下特征：灵敏度高；对所有的溶质都有响应；响应对流动相流量和温度的变化都不敏感；不引起柱外谱带扩展；线性范围宽；适用范围广3.4.2检测器分为通用型检测器和选择性检测器常用的检测器有紫外检测器（UVD）、示差折光检测器（RID）、电导检测器（ECD）、荧光检测器（FD）和蒸发激光散射检测器（ELSD）等。现在使用可调波长的紫外可见分光检测器，工作波长可在190-700
13、nm范围内任选，应用范围大大增加，以氘灯和钨灯为光源。差示折光检测器，是测量样品和流动相系统总的折光指数。为了得到足够的响应，采用差分技术补偿流动相的折光指数，任何物质只要其折光指数与洗脱液有足够的差别，就可以检测，所以适用范围广，但灵敏度低，选择性差，受温度干扰较大在农药分析中不常用。二极管阵列检测器（DAD）此外还有电化学检测器，敏感度高，但适用范围小。3.4.3判定检测器性能的指标主要有以下几方面：（1）灵敏度：以组分响应曲线的斜率来表示，斜率愈大，表示灵敏度愈高。（2）噪声：与样品无关的输出信号的变化，除了由于仪器的电子系统、电源电压或温度的波动外，洗脱液的气泡和污染可能是出现噪声的主
14、要原因。（3）漂移：基线随时间增加而产生的定向缓慢变化，噪声和漂移都直接影响检测能力和分析工作的误差。（4）最小检测限：色谱峰高度为最大噪声两倍时的检出量。（5）线性范围：检测器输出信号与被测组分量呈线性关系的范围。四、HPLC的分类根据固定相对样品分子的保留机理不同主要分为以下4种类型：1液固吸附色谱是用高比表面积的颗粒作固定相，根据物质对吸附剂活性表面的吸附能力的差异而进行分离。2液液分配色谱其固定相是由在组成上与流动相互不相溶的另一种液体或是借化学键合到颗粒或载体上，物质的分离是由于不同溶质在两个液相中分配系数不同而达到的。3离子交换色谱固定相是具有固定电荷的离子交换树脂，是根据移动相中
15、样本的不同离子对固定相固定电荷部位的亲和力大小不同而进行分离。4.化学键合相色谱法5凝胶色谱或空间排阻色谱固定相为不同孔径的多孔凝胶，是根据多孔凝胶对不同大小的分子的排阻效应进行分离。4.1液固吸附色谱法液固吸附色谱是液相色谱中研究和应用得最早的一种，以具有高比表面积的颗粒作为固定相，根据样本中各组分对固定相表面吸附作用的差异进行分离和分析的方法。适用于分离溶于有机溶剂、具有中等分子量、非离子型的化合物，对于具有不同官能团或不同数目的官能团的组分分子，具有很好的选择性，还特别适用于异构体的分离。在装填有吸附剂的层析柱内，当流动相流过吸附剂时，吸附剂表面被溶剂分子(S)以单分子层形式完全占有，当
16、样本分子(X)(或溶质分子)被流动相带人柱内，在移动的过程中便扩散到吸附剂表面和微孔内，并在所有表面上与已结合的溶剂分子（S）进行竞争吸附，见图55。如果试样分子(X)对吸附剂表面吸附基团的吸引力(包括色散力、诱导力，氢键等)大于溶剂分子(S)，溶剂分子被排斥，试样分子被吸附，则X取代S而吸附在吸附剂表面，称为竞争吸附现象。在一定的浓度范围内，这一吸附脱吸附过程是热力学平衡过程，这种竞争吸附达到平衡后，可用下式来表示：K为分配系数。如果溶剂分子吸附性强，则被吸附的试样分子(X)相应减少。4.1.1吸附色谱固定相的类别常用的吸附剂主要有硅胶和氧化铝等，氧化铝有时会发生催化反应，已很少使用。硅胶吸附剂用得最多，其特点为：化学性质稳定，不会与试剂发生反应；机械性能强，不会溶涨；由于多孔结构而具有高的线性容量；在制造过程中可以控制其物理性能，如比表面、孔结构等。吸附色谱主要是利用物质在吸附剂和流动相中的可逆平衡，以及吸附剂对不同物质吸附力的差异而使物质分离的。而
