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1、合肥工业大学（宣城校区）化工与食品加工系2015生物化学实验B实验讲义实验名称及学时安排编号实验名称学时1蛋白质的沉淀和变性反应42氨基酸的分离和鉴定双向层析法43总糖和还原性糖的测定3,5二硝基水杨酸法44*不同分子量蛋白质的分离凝胶过滤层析法45*SDS-PAGE法测定蛋白质分子量46*DNA的琼脂糖电泳4*实验1-3是食品科学与工程和化学工程与工艺专业的共有实验；实验4-6为食品科学与工程专业的专有实验。2014-2015（二）生物化学实验B课表生物化学实验课表（14级食品1-5班）周次节次星期一星期二星期三星期四星期五星期六星期日第5周1-41食品1班5-81食品4班7-91食品3班1
2、食品2班7-91食品5班第6周1-45-82食品5班7-92食品1班2食品2班7-92食品3班7-92食品4班第7周1-43食品1班4食品2班5-83食品2班3食品5班7-93食品4班3食品3班4食品1班第8周1-45-84食品4班7-94食品3班4食品5班第9周1-45食品3班5-85食品1班5-95食品4班5-9第10周1-45-85食品2班5-95食品5班5-9第11周1-46食品3班5-86食品1班6食品4班第12周1-45-86食品2班6食品5班实验一 蛋白质沉淀和变性实验一、实验目的1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。3. 了解蛋白
3、质变性与沉淀的关系。4. 了解蛋白质两性性质。二、实验原理在水溶液中，蛋白质分子表面形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似。但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的，相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，则以固态形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应。这种反应可分为以下两种类型：1可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部、空间结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再溶于原来的溶剂中。这种作用称为可逆沉淀反应。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用
4、于蛋白质以及利用等电点的沉淀，提纯蛋白质时，常利用此类反应。2. 不可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀不能再溶解于原来溶剂中的作用称为不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂，强酸、强碱、加热、震荡、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷）并不析出，因此，变性蛋白质不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。三、试剂和器材1. 试剂（1）蛋白质溶液取5ml鸡或鸭蛋清，用蒸馏水稀释至100ml，搅拌均匀后用48层纱布过滤，新鲜配置。
5、（2）蛋白质氯化钠溶液取20ml蛋清，加蒸馏水200ml和饱和氯化钠溶液100ml，充分搅匀后，以纱布滤去不溶物（加入氯化钠的目的是溶解球蛋白）。（3）蛋白质沉淀试剂硫酸铵粉末，饱和硫酸铵溶液(150ml)，3%硝酸银（280ml），0.5%乙酸铅（200ml），浓硫酸（5ml/组），5%磺基水杨酸（100ml），0.1%硫酸铜（100ml），饱和硫酸铜溶液（400ml），0.1%乙酸（500ml），10%乙酸（500ml），饱和氯化钠溶液（25ml），10%氢氧化钠溶液（500ml）。2. 器材试管，过滤漏斗，试管架，玻璃棒，沸水浴，量筒，烧杯，试剂瓶，移液管，滤纸，洗瓶，废液缸，药匙，移液
6、管架。四、实验步骤1. 蛋白质的可逆沉淀反应蛋白质的盐析作用(分级盐析)2. 蛋白质的不可逆沉淀反应（1）重金属沉淀蛋白质水3-4滴0.5%乙酸铅 1ml蛋白质溶液观察沉淀观察沉淀是否溶解（2）酸沉淀蛋白质水数滴5%磺基水杨酸1）磺基水杨酸对蛋白质的沉淀作用0.5ml蛋白质溶液观察蛋白质沉淀观察现象 摇动试管10滴浓硫酸2）浓硫酸对蛋白质的沉淀作用 6滴蛋白质溶液观察两液界面观察现象（3）加热沉淀蛋白质取5支试管，编号，按下表加入有关试剂（单位/滴）。试剂管号 蛋白质溶液0.1%乙酸10%乙酸饱和氯化钠10%氢氧化钠蒸馏水123451010101010555227225将各管混匀，观察记录各管
7、现象后，放入沸水浴中加热10min，比较各管的沉淀情况。五、思考题1. 蛋白质可逆沉淀与不可逆沉淀的本质区别是什么？2. 简述蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的相互关系。实验二 氨基酸的分离和鉴定双向层析法一、实验目的1. 学习双向纸层析的基本原理；2. 掌握双向纸层析法分离氨基酸混合物的方法；二、实验原理纸层析是以滤纸作支持物，用一定的溶剂系统展开，使混合样品达到分离分析的层析方法。其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中，点样在滤纸的一端；再选用适当的溶剂系统，从点样的一端通过毛细现象向另一端展开，展开完毕，取出滤纸晾干或烘干，再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经展开后某一物
8、质在纸层析谱上的位置常用比移值Rf来表示。Rf值 = 原点到层析点中心的距离/ 原点到溶剂前沿的距离纸层析可看作是溶质（样品）在固定相与流动相之间的连续抽提，由于溶质在两相之间的分配系数不同而达到分离。一定的物质在两相间有固定的分配系数，因而在恒定条件（液剂、PH、温度）下，各物质有固定的Rf值，据此可达到分析鉴定的目的。由于滤纸纤维可吸收2025%的水分；且其中67%以氢键形式与纤维素上羟基结合，一般条件下难脱去；所以纸层析实际上是以水相作固定相，展开的溶剂作流动相。纸层析操作按溶剂展开方向可分为上行、下行和径向三种。氨基酸分离一般用上行法。上行法又分单向（成分较为简单的样品）和双向（单向时
9、斑点重叠分离不开，于是在其垂直方向用另一种溶剂系统展层）。双相层析谱可分辨十几种以上的样品。层析溶剂要求：（1）被分离物质在该溶剂系统中Rf在0.050.8之间，各组分之Rf值相差最好能大于0.05，以免斑点重叠。（2）溶剂系统中任一组分与被分离物之间不能起化学反应。（3）被分离物质在溶剂系统中的分配较恒定，不随温度而变化，且易迅速达到平衡，这样所得斑点较圆整。本实验采用八种混合氨基酸为样品，用酸性和碱性两种溶剂进行双向层析，以茚三酮为显色剂，可获得分离清晰的层析图谱，如下图所示。图1. 8种氨基酸混合物双向层析结果图三、试剂和器材1. 试剂（1）测试样品：标准氨基酸混合溶液：亮氨酸、缬氨酸、
10、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸、组氨酸、丝氨酸各100mg溶于50mL 0.01M盐酸中。（2）溶剂系统：第一相：正丁醇88%甲酸水1532（V/V）；第二相：正丁醇吡啶95%乙醇水5111（V/V）。（3）显色剂：0.1%（W/V）茚三酮丙酮液。2. 器材层析缸2540cm（2）；培养皿15cm（2）；喷雾器；毛细管内径0.1cm；电吹风；烘箱；层析滤纸 1212cm；铅笔；尺；针线等。四、实验步骤1. 点样取层析滤纸一张（1212cm），在距纸边1.2cm处划一基线；再将纸转90，距纸边1.2cm处作一线与上线垂直。以毛细管吸取混合氨基酸溶液，点与二线交点处（如下图），点的直径控制在
11、2mm左右，不可过大。待样品干燥后再点一次。滤纸上点样斑点干燥后，把滤纸卷成圆筒形，纸的两边以铬丝相连（或以针线缝合），但不可重叠相碰。2. 展层在层析缸中平稳的放入装有第一相层析溶剂的培养皿。将圆筒形滤纸放入，点样一段接触溶剂，以点样处不浸入溶剂为准。待溶剂自下而上均匀展开，约2小时后溶剂到达距纸边0.5cm处取出滤纸，悬挂于室温中，用电吹风充分吹尽溶剂。然后裁去未走过溶剂的滤纸边缘，将滤纸转90，卷成如前圆筒状，放入盛第二相溶剂的层析缸内展开（如下图），约1小时后溶剂展开到距纸边0.5cm时取出，用电吹风吹尽溶剂使其干燥。图2. 纸层析点样和展层示意图3. 显色用喷雾器将茚三酮均匀地喷在滤
12、纸上，然后悬滤纸于65烘箱内，烘30分钟，即可看到紫红色氨基酸斑点，将图谱上的斑点用铅笔圈出。用直尺量出各斑点中心与原点的距离以及溶剂前沿与原点的距离，求出各氨基酸的Rf值。将各显色斑点的Rf值与标准氨基酸的Rf值比较，可得知该斑点的准确成分。五、思考题1、酸性与碱性溶剂系统对氨基酸极性基团的解离各有何影响？2、为什么展层时要用两种溶剂系统？实验三 3.5-二硝基水杨酸法测定总糖和还原性糖的含量一、实验目的1. 掌握还原糖和总糖的测定原理2. 学习用比色法测定还原糖的方法二、实验原理在NaOH和丙三醇存在下，3,5二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶
13、液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。三、试剂和器材1. 材料无糖藕粉和玉米淀粉2. 试剂（1）3,5二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000ml容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325ml，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000ml。（2）葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为2.0mg/ml。（3）6mol/L HCl：取250ml浓HCl（35%38%）用蒸馏水稀释到500ml。（4）碘-碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。（5）6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。（6）0.1% 酚酞指示剂。3. 器材托盘天平；量筒（10ml或25ml）；大（小）试管；白瓷板；试管架；移液管；三角漏斗；滤纸；烧杯（400mL）；水浴锅；长玻璃棒；分光光度计四、实验步骤1. 葡萄糖标准曲线的制作注意 标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色取5支15mm180mm试管，按下表加入2.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。管号葡萄糖标准液蒸馏水葡萄糖含量 OD540/ml/ml/mg0
