细胞凋亡与细胞坏死

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1、细胞凋亡与细胞坏死 细胞凋亡（科普 诗） 似秋叶的凋零， 告别生命之辉煌； 那难以计数的攻击、诱导， 轻启着道道程序， 逼细胞步步走向生命的末端； 啊，活性氧处处肆虐， 钙波涛惊石裂岸， 线粒体把生命之光一点一点拧淡; 细胞凋亡（科普诗 ） 似秋叶的凋零， 告别生命之辉煌； 那难以计数的攻击、诱导， 轻启着道道程序， 逼细胞步步走向生命的末端； 啊，活性氧处处肆虐， 钙波涛惊石裂岸， 线粒体把生命之光一点一点拧淡; 危难中的细胞啊， 你沉稳不乱， DNA片片切割， 化云梯直通天堂； 细胞体分团相聚， 把生命的凝重浓集在小体上； 分别了朝夕相处的伙伴， 再见了快乐美好的时光； 这一切的一切又融入

2、临近的胞体， 腾出的空间再写生命的篇章。 细胞死亡形式 1. 细胞坏死 由于比较强烈的有害刺激 或细胞内环境的严重紊乱而导致的细 胞死亡。 2. 细胞凋亡 由体内外因素触发细胞内 预存的死亡程序而导致的细胞死亡过 程称为细胞凋亡（apoptosis),又称程 序性细胞死亡（programmed cell death,PCD)。 坏死 凋亡 1.性质病理性,非特异性生理性或病理性，特异性 2. 诱导因素强烈病理性刺激,随机发生生理性或较弱病理性刺激,非随机发生 3. 生化特点被动过程,无新蛋白合成,不 耗能 耗能的主动过程，有新蛋白合成 4. 形态变化细胞结构全面溶解、破坏、 细胞肿胀 胞膜及细

3、胞器相对完整细胞皱缩，核 固缩,膜可发泡成芽,形成凋亡小体 5.DNA电泳弥散性降解，电泳呈均一 DNA片状 DNA片段化（180-120bp）,电泳呈“ 梯”状条带 6. 炎症反应溶酶体破裂，局部炎症反应 溶酶体相对完整，局部无炎症反应 7.凋亡小体无有 8.基因调控无有 细胞凋亡与坏死的比较 细胞凋亡的生理和病理意义 1.确保正常发育、生长:指趾间隙形成； 2.维持内环境稳定:组织细胞更新(上皮组织/血 细胞/衰老细胞)、生理器官内分泌调控（子 宫产后复员/月经期子宫内膜脱落）、受损 不能修复细胞或突变细胞清除； 3.发挥积极的防御功能：病原微生物的宿主细 胞发生主动凋亡。 细胞凋亡与疾病

4、发生机制的新认识 1.该“死”的细胞（如肿瘤细胞、自身反应性免疫细胞） 未死，是造成肿瘤、自身免疫性疾病的主要发病机制 之一。细胞凋亡不足 2.不该“死”的细胞（如神经元、心肌细胞）死 了，这与老年性痴呆、心肌缺血/再灌注损伤等 发病有关。细胞凋亡过度 细胞凋亡的过程 1.凋亡信号转导 2.凋亡基因激活 3.细胞凋亡的执行 4.凋亡细胞的清除 凋亡过程及分期 诱导期 执行期 消亡期 凋 亡 诱 导 因 素 受 体 cAMP Ca2+ 神 经 酰 胺 死 亡 信 号 凋 亡 相 关 基 因 激 活 Dnase 激活 Capases 激活 巨噬细胞 吞噬细胞 凋亡细胞 凋亡时细胞的主要变 化 一、

5、细胞凋亡的形态学改变 1.细胞膜的变化：微绒毛、细胞突起和细胞表面皱褶消失； 胞膜空泡化，内质网不断扩张并与胞膜融合形成芽状突起 （出芽）； 2.细胞质变化：胞质浓缩、细胞器变化（线粒体变大脊增多 可空泡化，内质网腔扩大提供包裹膜）； 3.细胞核变化：核内染色质浓缩边集 空泡化、固缩、出芽、边集、凋亡小体 （apoposis boby） 最早期形态学改变是细胞间的间接 丢失 与邻近细胞脱离并失去微绒毛 胞浆浓缩及核质密度增高 （DNA 断裂） 凋亡小体 识别、吞噬（无 炎症反应） 典型的凋亡小体（apoposis boby ）：由透亮空泡和不透光的 浓密的核碎片两部分组成 。 胸腺细胞 正常凋

6、亡 胸腺细胞 正常 凋亡 细胞凋亡的生化改变 1.DNA的片段化“梯”状条带 2.内源性核酸内切酶激活及其作用 3.凋亡蛋白酶（caspases）的激活及其作用 1.DNA的片段化“梯”状条 带为细胞凋亡主要特征 几乎所有凋亡细胞均有核小体间的裂 解，导致DNA 的断裂； DNA降解过程的特异性：不伴有组蛋 白和其它核蛋白的降解； 染色质在核小体间的裂解是凋亡细胞 和形态改变的基础； DNA 片段化是凋亡的“黄金标记”。 2.内源性核酸内切酶激活及其作用 由一系列胞内信号转导环节激活， 执行染色质DNA切割 3. Caspase 9 激活，需要通过CARD（ caspase-recruitme

7、nt domain)、Apaf-1、 细胞色素c、ATP等多个因子的参与 1.灭活细胞凋亡的抑制物（如Bcl-2）； 2.水解细胞的蛋白质结构，导致细胞解体，形成凋亡 小体（apoposis boby）； 3.在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白，使该蛋白获 得或丧失某种生物学功能 Caspases在凋亡中的主要作用 细胞凋亡的调控 （一）细胞凋亡相关因素 1.诱导性因素 2.抑制性因素 (二) 细胞凋亡信号的转导 1.细胞凋亡的诱导因素 J.生理活性因子：TNF家族（Fas-L,TNF) 、 TGF、神 经递质(谷氨酸、多巴胺)、生长因子撤退 、GC等 J.损伤相关因子：热休克、病毒感染、自 由

8、基、癌基因、抑癌基因、放射线等 J.化疗药物 J.毒素：乙醇、 -淀粉样肽 2.细胞凋亡的抑制因素 .凋亡相关基因的抑制作用：p53、bcl-2、 bcl-XL等。 .生理性抑制剂：生长因子、细胞外基质、 锌、雄激素、雌激素等 .病毒基因：腺病毒E1B、杆状病毒p35、棒 状病毒IAP、牛痘病毒CrmA、EBV BHRF1等 .药物：Calpain抑制剂、caspases抑制剂、促 癌剂、佛波豆蔻乙脂(PMA)等 (二)细胞凋亡信号的转导 -凋亡信号转导系统特点 多样性：不同种类的细胞系统不同 偶联性：与增殖分化的信号系统交叉偶联 同一性：多因素，共用同一系统触发 多途性：同一诱导因素启动多条

9、信号转导 途径 细胞凋亡信号的转导 诱导信号 cell R 神经酰胺 多途径 R SAPK/JNK P53 基因 NF-kB,JNK/AP-1途径 激活bax or 下调bcl-2 ROS mtDNA 细胞凋亡相关基因 抑制凋亡基因：bcl-2 促进凋亡基因： fas，P53 双向调控基因： c-myc，bclx Bcl-2抗凋亡机制 直接的抗氧化 抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质 抑制促凋亡的Bax，Bak细胞毒作用 抑制Caspases激活 维持细胞钙稳态 细胞凋亡发生机制 （一）氧化损伤 （二）钙稳态失衡 (三) 线粒体损伤 （一）氧化损伤机制 氧自由基可破坏机体正常的氧化/还原 的动态平衡

10、，造成生物大分子的氧化 损伤，干扰正常的生命活动，形成严 重的氧化应激状态后果：诱导细 胞凋亡。 （二）钙稳态失衡引起细 胞凋亡的可能机制 1.激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶(DNase)，降 解DNA链； 2.激活谷氨酰胺转移酶，催化细胞内肽链间的酰 基转移，在肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋 白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成 ； 3.激活核转录因子，加速细胞凋亡相关基因的转 录； 4.Ca2+在ATP的配合下使DNA链舒展，暴露出核 小体之间的连接区内的酶切位点，有利于 DNA内切酶切割DNA。 细胞凋亡的生物学意义 1.发育 从低等动物到高等动物的发育，都存在着 程序性细胞

11、死亡的现象。 2.免疫系统 淋巴细胞发育分化成熟过程中，始终 伴随着细胞凋亡。 3.衰老 细胞凋亡与许多年龄相关疾病有直接或间 接的联系。 4.损伤与修复 5.肿瘤发生 细胞增殖与死亡的速度平衡失调。 6.病毒致病 病毒表达抗凋亡蛋白。 细胞凋亡的检测 随着研究技术的提高和对凋亡的认识不断深 入，检测凋亡的方法已从细胞、染色质到分 子水平日趋完善和成熟。 1.形态学检测 2.DNA降解分析 3.凋亡酶学分析 4.凋亡相关蛋白分析 5.流式细胞分析 一细胞凋亡的形态学分 析 细胞凋亡的形态学变化主要表现 为：细胞皱缩(cell shrinkage)，失去细 胞连接(cell junction)，

12、微绒毛 (microvilli)消失，发泡(blebbing)，染色 质浓集并靠近核膜，形成沿核膜收缩的 新月状体(crescents)，形成凋亡小体 (apoptotic body)等。 细胞凋亡的形态学检测方法 检测检测 方法 可鉴鉴定凋亡细细胞特征 光学显显微镜镜 相差显显微镜镜 透射电镜电镜 聚焦激光扫扫 描电镜电镜 扫扫描电镜电镜 流式细细胞仪仪 缩时摄缩时摄 影术术 细细胞体积缩积缩 小、核浓缩浓缩 、细细胞周围围透明圈 细细胞发发泡、凋亡小体 微绒绒毛消失、染色质质沿核膜分布、新月体状 核、凋亡小体 凋亡细细胞内固缩缩染色质质及核碎片定位 细细胞膜表面泡状鼓起 低前向散射光(FS

13、C)、高侧侧向散射光(SSC) 凋亡细细胞的形成过过程 二. DNA降解分析 DNA降解过程的特点： 1. 发生于凋亡早期，由内源性核酸内切 酶激活引起 2. DNA在核小体连接部位断裂，产生 180200bp为最小单位的单体或寡聚体 片断 3. DNA碎片可被细胞膜包裹，形成凋亡 小体 (一) DNA凝胶电泳 原理：凋亡细胞降解产生一系列 规则的DNA片断，其电泳结果呈典型的“ 梯状带”(ladder)；而坏死或凋亡后坏死 细胞的DNA分解是随机的，产生的碎片 分子量大小不一，在电泳时形成“ 涂片 状”(smear)。 普通琼脂糖凝胶电泳、Southern blotting、放射自显影(32

14、PdATP或 32PdCTP连接到DNA片断的3 端) (二)原位标记法 TUNEL(TdT mediated dUTP nick end labeling)终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原 位缺口末端标记技术。 原理：在TdT的作用下，带有标记物的dUTP 被连接在断裂DNA3末端，然后通过相应的方 法检测标记物，从而判断是否有凋亡发生。 应用范围：石蜡包埋的组织切片、冰冻组织切 片、培养细胞、组织中分离的细胞 (三) ELISA法 原理：以抗组蛋白抗体包被微孔板 壁，加入标本，凋亡细胞的核小体可与抗 体结合，再加入抗-DNA片断-POD复合 物，与核小体中的DNA片断结合，最后 加入POD

15、显色底物，以酶标仪测定光密 度以进行定量分析。 三. 凋亡酶学分析 1. 内切核酸酶(endonuclease, DNase) 种类：DNase （内质网、高尔基体), DNase （溶酶体、胞核)，NUC18（胞核 ，胸腺细胞中) 等 作用：使DNA断裂成180200bp或其 倍数的片断 激活机制：CAD(caspase-activate DNase) ICAD(inhibtor of CAD) 检测：Western Blotting Caspases的检测 1. Caspase-3活性测定(FIENA法) 荧光测定免疫吸附法(flurometric immunosorbent enzyme assay, FIENA), caspase-3可作用于连接荧光素的特异底物乙酰 化天冬氨酸-谷氨酸-颉氨酸-天冬氨酰胺(Ac- DEVD), 产生发荧光的裂解产物AFC，且caspase -3活性与Ac-DEVD-AFC分解的量或自由荧光 AFC产生荧光的强弱成正比，故可定量检测 2. 蛋白印迹法 Caspases作用底物的检测 PARP89kD的检测 四. 凋亡相关蛋白分析 1. Bcl-2家族 促进凋亡：Bax, Bal, Bcl-Xs, Bad, B