生物分离工程 沉淀法讲解

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1、 生物分离过程的一般流程 原料液 细胞分离(离心，过滤) 细胞胞内产物 路线一路线二 细胞破碎 碎片分离 路线一A 路线一B 清液胞外产物 粗分离(沉淀/超过滤/萃取) 纯化(层析、离子交换、吸附) 脱盐(凝胶过滤、超滤) 浓缩(超滤) 精制(结晶、干燥) 包含体 溶解(加盐酸胍、脲) 复性 n什么是沉淀法？ n沉淀法纯化蛋白质的优点有哪些？ n常用的沉淀方法包括哪些？ n何谓盐析？其原理是什么？ n常用的盐是什么，影响盐析的主要因素有哪些？ n有机溶剂沉淀法的原理是什么？ n影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？ n等电点沉析的工作原理是什么？ 通过本章学习应掌握以下内容 沉淀：利用沉析剂使生化

2、物质在溶液中的溶解度降低 而形成无定形固体沉淀的过程。 沉淀法的目的： (通过沉淀达到浓缩的目的； (沉淀方法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需 成分，初步 纯化 ； (将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一 步处理。 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目 前仍广泛应用在工业上和实验室中。 16.1 概述 沉淀法的原理： (生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的， 这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这 些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。 (沉淀法基本原理就是采用适当的措施改变溶液 的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，根 据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的 目

3、的， (溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶 液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度 产生明显的改变。 16.1 概述 n 沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除 去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉 析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透 析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。 n操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小 时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤通 常按三步进行： 概述 沉淀法操作步骤 ： 首先加入沉淀剂， 沉淀剂的陈化，促进粒子生长； 离心或过滤，收集沉淀物。 加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度 、收率和沉淀物的形状都有很大影响。 概述 沉淀生成动力学

4、 溶解度值的降低是一个动力学过程。当体系 变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚并作用 。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起： 热运动，Bromnian运动； 对流运动，由机械搅拌产生； 差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成 的。 为了简化沉淀过程动力学， 可把沉淀过程分成下述个步骤： n(1) 初始混合 n(2) 新相生成 n(3) 布朗运动凝集 n(4) 机械碰撞凝集 n(5) 聚集体陈化 n(6) 聚集体沉淀 沉淀生成动力学 沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设备， 且易于放大，也广泛用于生产的制备过程， 是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶 时最常用的方法。 l l 优点：操作简

5、单、经济、浓缩倍数高优点：操作简单、经济、浓缩倍数高 l l 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择 性不强性不强 概 述 沉淀法的分类 根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： （1）盐析法； （2）等电点沉淀法； （3）有机溶剂沉淀法； （4）非离子型聚合物沉淀法； （5）聚电解质沉淀法； （6）复合盐沉淀法等 （7）亲和沉淀法 （8） 选择性沉淀法。 16.1 蛋白质的溶解特性 n蛋白质是两性高分子电解质（amphoteric polymer ），主要由疏水性各不相同的 20 种氨基酸组成。 n在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向 内部

6、折叠的趋势，即便如此，一般仍有部分疏水性 氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨 基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。 n亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外 表面。 n因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷 电区、亲水区和疏水区构成。 蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域 蛋白质的溶解特性 n蛋白质的溶解行为由其组成、构象以及 分子周围溶液性质所决定。 n蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所 以其大部分是亲水的，但其内部大部分是 疏水的。 n一般而言，小分子蛋白质比起在化学上 类似的大分子蛋白质更易溶解。 防止蛋白质凝聚沉淀的屏障 u蛋白质周围的水化层（hydration

7、 shell)， 保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞，使蛋白质 形成稳定的胶体溶液。 u蛋白质两性电解质，两性电解质，分子间静电排斥作用。 （存在双电层）蛋白质粒子在水溶液中是带电的 ，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基 团的电离。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的 电荷构成双电层。 16.盐析 Salt induced precipitationSalt induced precipitation 盐析 概念：概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等 生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉生物大分子物质在水溶

8、液中的溶解度降低，产生沉 淀的过程。淀的过程。 盐析是可逆的，而变性是不可逆的 早在1859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离 蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分 级中使用，得到了比较满意的结果。 盐析法机理 （1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集 ， 将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子 有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层 减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。 （2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由 于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域 越多，越易沉淀。 （3）中和电荷，减少静电斥力， 中性 盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和 ，静电斥力降低，导

9、致蛋白溶解度降低，使蛋白质 分子之间聚集而沉淀。 盐析过程盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两 种情况：种情况： （1 1）“ “盐溶盐溶” ”现象现象(salt-in)(salt-in)低盐浓度下，增加蛋白低盐浓度下，增加蛋白 质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大 。 （2 2）“ “盐析盐析” ”现象现象(salt-out)(salt-out)高盐浓度下，中和电高盐浓度下，中和电 荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降 。 l l 盐析作用要强盐析作用要强 l l 盐

10、析用盐需有较大的溶解度盐析用盐需有较大的溶解度 l l 盐析用盐必须是惰性的盐析用盐必须是惰性的 l l 来源丰富、经济来源丰富、经济 1）盐析用盐的选择 盐析用盐的选择盐析用盐的选择 在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有 一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作 用较强，半径大的低价离子作用较弱 阴离子盐析效果 ： 柠檬酸PO43- SO42- CH3COO- Cl- NO3-SCN- 阳离子盐析效果： NH4+ K+Na+ 高价阳离子 阴离子的影响大于阳离子 盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠 硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂 u（1） 价廉 ； u（2）

11、溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来 ； u（3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好， u（4）不易引起蛋白质变性。 盐析用盐的选择 n缺点： n（1）水解变酸； n（2）高pH 释氨，腐蚀； n（3）残留产品有影响。 盐析操作(加盐方式） 硫酸铵的加入有以下几种方法： 1）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情 况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入， 并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高； 2）加入饱和溶液法 用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大 的情况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。 3）透析平衡法 先将盐析的样品装于透析袋中，然后

12、浸入饱和 硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目 的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果 好，但程序烦琐，故多用于结晶。 u一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越 低。 u在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离 子强度顺次进行。 u每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心 收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使 另一种蛋白质组分盐析出来。 u组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐 的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易沉 淀。 2）盐浓度对盐析效果的影响 S=-s S蛋白质的溶解度，g/L; I离子强度， I=1/2mizi2 mi离子 i的摩尔

13、浓度； Zi所带电荷 常数，图中截距 Ks盐析常数，图中直线斜率 Cohn经验式 蛋白质溶解度与盐浓度的关系 和Ks的物理意义 代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的 假想溶解度的对数。与蛋白质种类、温度、pH值有关， 与盐无关； Ks盐析常数，代表图中直线的斜率； 从一些实验结果表明，Ks与温度和pH无关，但和蛋白质 与盐的种类有关。但这种变化不是很大，例如以硫酸铵 作为沉淀剂时，Ks值对不同的蛋白质来说，其变化不会 超过1倍。 用盐析法分离蛋白质的二种方法 盐析法分为两类， 第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通 过改变离子强度实现，（固定pH, 温度，改变盐 浓度），由于蛋白质

14、对离子强度的变化非常敏感 ，易产生共沉淀现象，用于早期的粗提液； 第二种叫分段盐析法，在一定离子强度下通 过改变PH和温度来实现，（固定离子强度，改变 pH及温度），由于溶质溶解度变化缓慢，且变化 幅度小，因此分辨率更高，用于后期进一步分离 纯化和结晶。 n虽然Cohn公式能够描述盐析状态下蛋白 质的溶解度，但它不能体现低盐浓度（盐 溶状态）下蛋白质的溶解度。 nMelander和Horvath根据 Sinanoglu有关 蛋白质盐析时溶剂和溶质相互作用理论（ 空腔理论）， 提出了不同盐浓度下的蛋白 质溶解度的计算方程式： 盐析用盐量的确定-饱和度： uu饱和度（饱和度（SaturationS

15、aturation）的概念：）的概念： 以硫酸铵为例：以硫酸铵为例：2525 0 0 C C时，硫酸铵的饱和溶解度时，硫酸铵的饱和溶解度 是是767g/L767g/L定义为定义为100%100%饱和度饱和度 u目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸 铵浓度或饱和浓度可通过实验确定。 u对多数蛋白质，当达到85%饱和度时，溶解度 都小于 0.l mgL，通常为兼顾收率与纯度，饱 和度的操作范围在40%-60%之间。 硫酸铵盐析过程 最适饱和度是30%，55% 20 4060800100 总蛋白 目标蛋白质 上清液蛋白浓度 l由于不同的蛋白质溶解度 不同，沉淀时所需的离子 强度也不相同， l如果

16、需要先除去些杂蛋白 ，然后在较高的饱和度下 ，沉淀目标蛋白质，则可 采用分段盐析 改变盐的浓度，可将混合 液中的蛋白质分批盐析分 开。 l如半饱和硫酸铵可沉淀血 浆球蛋白，饱和硫酸铵则 可沉淀包括血浆清蛋白。 分段盐析(fractional salting out) 盐析的影响因素：3）pH值 u一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大， 净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度 最小。 u为提高盐析效率，多将溶液PH值调到目的蛋白的 等电点处。 u注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓 度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整溶 液PH值，以达到最好的盐析效果。 pH值 PH 两种蛋白质的相对溶解 度会随pH而变化很大； 随pH 变化 （1）对数关系 （2） 等电点附近有极小值 lgS 在进行盐折时，必 须控制pH 图中直线都相互平 行 Ks pH值 盐析影响因素：4）温度的影响 u在低离子强度或纯水中，蛋白 质溶解度在一定范围内随温度增 加而增加。 u