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1、中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 、 论文作者签名：憋日期：塑1 2 ：兰竖 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究 生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国
2、医科大学。本人保 证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科 大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学 校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密 内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 日 期：基 IJllllJll l f ll f f f l ll fIIr II IIIII 1 1IIIII Y 17 6 8 8 4 6 目录 一、摘要 中文论著摘要l 英文论著摘要6 二、英文缩略语1 1 三、论文 胎盘生长因子介导小细胞肺
3、癌细胞穿过血脑屏障的体内研究 前言l2 材料与方法1 3 实验结果2 6 讨论4 0 结论4 l 四、本研究创新性的自我评价一4 2 五、参考文献4 3 六、附录 综j 岙4 6 在学期间科研成绩5 6 致谢5 7 个人简介5 8 中文论著摘要 胎盘生长因子介导小细胞肺癌细胞 穿过血脑屏障的体内研究 目的 流行病学调查表明，大约有1 0 - - 一3 0 的癌症患者发生肿瘤脑转移，我国每年 的新增脑转移瘤病例大约为1 7 万。在各种脑转移肿瘤中以肺癌脑转移居多，约 占全部病例的3 0 ，其中小细胞型肺癌( s m a l lc e l ll u n gc a n c e l “ ，S C L
4、C ) 具有恶性度 高，脑转移发生时间早的特点。大约有5 0 的小细胞肺癌患者发生脑转移，其中 有1 0 - - 一2 0 的患者以脑部转移瘤形成为疾病的首发症状，而8 0 的患者在确诊后 两年发生脑转移，病人的致死、致残率高，预后差。因此，探讨小细胞肺癌脑转 移的分子机制对于小细胞肺癌的防治具有重要的意义。 肿瘤转移是一个复杂多步骤的病理过程，器官血管壁的通透性将影响肿瘤细 胞的转移。脑的血管系统具有特殊的血脑屏障( b l o o d b r a i nb a r r i e r ，B B B ) 结构，这 个屏障在一定程度上可以阻止致病因子对脑的侵害，但是小细胞肺癌向器官转移 表现出对脑
5、的“亲嗜性”，这一病理特点提示小细胞肺癌可能具有影响血脑屏障 通透性的肿瘤特性。近年的研究发现了一些与小细胞肺癌骨转移相关的基因( 如 P r e p r oG R P 和N M B R ) ，并且发现其转移与肺癌细胞表面的酪氨酸激酶受体活性 增高有关。本室研究发现，在小细胞肺癌细胞穿过人脑微血管内皮细胞( h u m a n b r a i nm i c r o v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l s ，H B M E C ) 过程中激活了R h o R O C K 通路，使 a c t i n 细胞骨架重排，破坏H B M E C 间紧密
6、连接( t i g h t j u n c t i o n ，T J ) 的完整性，从 而促进小细胞肺癌细胞穿过血脑屏障( F E B Sl e t t e r s ，2 0 0 6 ，5 8 0 ：4 2 5 2 - 4 2 6 0 ) 。 近年来，血管内皮生长因子( v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r , V E G F ) 与恶 性肿瘤的关系受到重视，发现恶性肿瘤组织V E G F 表达上调，不仅能促进肿瘤血 管形成、促进肿瘤生长，还能通过促进血管的渗透性来加速肿瘤组织细胞进出血 管，因而加速了肿瘤的转移。
7、胎盘生长因子( p l a c e n t a lg r o w t hf a c t o r , P L G F ) 是血 管内皮细胞生长因子( V E G F ) 家族中的一员，多在病理条件下发挥生物学功能。 在肿瘤研究中发现，P L G F 主要通过促进肿瘤血管的新生而影响肿瘤的增殖。P L G F 可以通过与V E G F R - 1 F I t - 1 受体结合，协同V E G F 发挥血管生成的作用。此外， 还可以募集循环中的造血干细胞和单核细胞到肿瘤原发灶，促进肿瘤血管的增殖。 近来的研究表明，P L G F 在肿瘤发生中具有双重作用，一可以直接作用于肿瘤细胞 而影响肿瘤细胞的迁
8、移，二可以作用于血管内皮细胞影响其功能。本室进一步研 究发现P L G F 在小细胞肺癌细胞穿过B B B 过程中发挥了重要作用，其与脑微血管 内皮细胞上的V E G F R - 1 F I t 1 受体相结合，引发下游信号通路，激活R h o R O C K 通路，进一步使细胞骨架系统重排、紧密连接破坏，从而使肿瘤细胞穿过血脑屏 障。 本研究主要是在l i f 期研究的基础上通过动物实验进一步验证P L G F 是否在 S C L C 穿过血脑屏障过程中发挥了作用。 方法 l 、R T q P C R 检测P L G F 在不同肺癌细胞中的表达情况 2 、利用体外血脑屏障模型，比较六种肺癌细
9、胞穿过H B M E C 单层 的情况 3 、利用R N A i 技术，构建以腺病毒为载体的s i P L G F 表达系统，获 得病毒颗粒 ( 1 ) 含目的基因( s iP L G F ) 穿梭子( s h u t t l e ) 的构建 构建双链s iP L G F ：双链短发夹o l i g oD N A 退火连接 线性化s h u t t l e 空载体与双链s iP L G F 的连接 重组质粒的转化、筛选和鉴定 ( 2 ) 腺病毒的重组 线性化载体s h u t t l e ( s iP L G F ) 2 s h u t t l e 和p A d E a s y 腺病毒载体共转
10、化细菌B J 518 3 重组子的筛选和鉴定 重组子( A d s h u t t l e s i P L G F ) 的大量扩增 ( 3 ) 病毒颗粒的包装 A D 2 9 3 细胞的培养 初级病毒颗粒的形成 二级病毒颗粒的形成 三级病毒颗粒的形成 病毒颗粒滴度的测定 4 、A d s i P L G F 感染3 种S C L C ，检测其穿过H B M E C 单层的情况 ( 1 ) 腺病毒感染3 种S C L C ( 2 ) R T q P C R 鉴定P L G F s i R N A 干扰效果 ( 3 ) 检测感染后的S C L C 穿过H B M E C 单层的情况 5 、体内实验
11、 ( 1 ) 经心室内途径接种肺癌细胞，分析不同肺癌细胞在动物体内的成瘤特性 接种前细胞的处理 分别经心室内途径接种6 种肺癌细胞 观察脑内和肺部的成瘤情况 ( 2 ) 颈内动脉接种腺病毒感染的S C L C 腺病毒感染3 种S C L C 分别经颈内动脉途径接种感染S C L C 观察脑内和肺部的成瘤情况 3 结果 1 、P L G F 在不同肺癌细胞中的表达情况 R T q P C R 检测不同肺癌细胞中P L G F 的表达，N C I H2 5 0 ( 来源于小细胞肺 癌脑转移灶) 和N C I H2 0 9 ( 来源于小细胞肺癌骨髓转移灶) 两株小细胞肺癌细胞 P L G F 高表达
12、；而N C I H 4 4 6 ( 来源于小细胞肺癌胸水渗漏的细胞) 则P L G F 表达较 低。而A5 4 9 、N C I H 4 6 0 和N C I H 2 9 2 低表达P L G F 。结果表明：P L G F 可能与肿 瘤转移相关，而且与脑转移相关性大。 2 、利用体外血脑屏障模型，比较六种肺癌细胞穿过H B M E C 单层 的情况 利用体外血脑屏障模型，检测C F S E 荧光染色的六种肺癌细胞穿过H B M E C 单 层的情况，三种小细胞肺癌细胞( N C I H 2 5 0 、N C I H 2 0 9 、N C I H4 4 6 ) 穿过数明显 高于非小细胞肺癌(
13、A5 4 9 、N C I H 4 6 0 、N C I H 2 9 2 ) 。 3 、构建以腺病毒为载体的s i P L G F 表达系统，获得病毒颗粒 ( 1 ) 成功构建了携带短发央s iP L G F 的穿梭载体：s h u t t l e ( s iP L G F ) ，并与 腺病毒骨架载体成功重组，获得腺病毒R N A i 重组子( A d s h u t t l e s iP L G F ) 。 ( 2 ) 完成A D2 9 3 细胞三次病毒包装并获得了病毒颗粒，含量为1 5 x 1 0 1 1 v i r u s e s 。 4 、A d s i P L G F 感染3 种小细
14、胞肺癌细胞，检测其穿过H B M E C 单层的情况 ( 1 ) 腺病毒感染N C I H 2 5 0 、N C I H 2 0 9 、N C I 4 4 6 三种细胞。 ( 2 ) R T q P C R 检测腺病毒感染的3 种小细胞肺癌细胞P L G F ，A d s i P L G F 组的P L G F 表达明显少于两个对照组。 ( 3 ) 与感染A d s h u t t l e v e c t o r 和A d s h u t t l e s c r a m b l e 的细胞相比，P L G F 沉默 的S C L C 穿过H B M E C 单层的细胞数明显减少。 5 、体内实验 4 ( 1 ) 经心室内接种6 种肺癌细胞，在动物体内成瘤性有明显差异 N C I H 4 4 6 和N C I H 4 6 0 细胞成瘤性最好，N C I H 2 9 2 和A 5 4 9 细胞成瘤性较好， 而N C I H2 0 9 和N C I H2 5 0 细胞则成瘤性较差。六种肺癌细胞在肺部均可见成瘤， 但未发现一例脑内转移瘤。 ( 2 ) 颈内动脉接种腺病毒感染的S C L C 成瘤情况 三种小细胞肺癌细胞具有不同的脑转移能力，N C I H 2 0 9
