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1、福建医科大学 硕士学位论文 脑心通对CYP2C192基因突变气虚血瘀体质志愿者氯吡格雷 抗血小板作用的调节 姓名：余广炜 申请学位级别：硕士 专业：内科学（心血管病） 指导教师：陈慧;吴小盈 20100501 脑心通对C Y P 2 C 19 * 2 基因突变气虚血瘀体质志愿者氯吡格 雷抗血小板作用的调节 中文摘要 目的：探讨C Y P 2 C 1 9 “ 2 基因突变致氯吡格雷抵抗气虚血瘀体质志愿者接受脑心通 干预后对血小板功能的影响。 方法：1 、通过多聚酶链限制性片段长度多态性( P C R R F L P ) 方法检测3 6 0 名2 5 5 5 岁男性体检志愿者C Y P 2 C 1
2、 9 “ 2 基因多态性。2 、从3 6 0 名男性体检志愿者中选取1 8 名气虚血瘀体质志愿者( 其中C Y P 2 C 1 9 幸1 产1 野生型、C Y P 2 C 1 9 * 1 2 突变型杂合子、 C Y P 2 C 1 9 * 2 * 2 突变型纯合子各6 名) ，签署知情同意书后，服用氯吡格雷7 天( 第 一天负荷剂量3 0 0 m g ，之后7 5 m g d ) ，经洗脱期7 天后，用脑心通( 0 8 9 次，3 次 天) 预处理5 天，之后继续服用脑心通加氯吡格雷7 天( 用法同上) 。分别测定服药 前基线状态、服用氯吡格雷后4 小时、2 4 小时、3 天、7 天的A D
3、P 诱导的血小板聚 集率( 比浊法) ；同时测定服药前基线状态、服用氯吡格雷第7 天、洗脱期第7 天、 服用脑心通第5 天及合用后第7 天的血小板数、选用流式细胞法测定A D P 诱导的血 小板聚集率、C D 6 2 P 、P A C - I 和酶联接免疫吸附剂测定法测定s C D 4 0 L 的变化。 结果：1 、C Y P 2 C 1 9 2 基因型分布符合H a r d y W e i n b e r g 遗传平衡( P 均 0 0 5 ) ，样本具 有群体代表性。 2 、( 1 ) 接受药物试验前C Y P 2 C 1 9 * 1 * 1 野生型、C Y P 2 C 1 9 * 1 2
4、 突变型杂合子和 C Y P 2 C 1 9 “ 2 2 突变型纯合子间B M I 值、血生化指标、血小板数、A D P 诱导的血小板 聚集率以及C D 6 2 P 、P A C 一1 、s C D 4 0 L 等差异无统计学意义，比浊法及流式细胞法测定 A D P 诱导的血小板聚集率有良好的相关性( r = O 3 9 7 ，P = O 0 0 4 ) ；( 2 ) 三组基因型个体 服用氯吡格雷后4 小时、2 4 小时、3 天和7 天测定A D P 诱导的血小板聚集率( 比浊 法) 较服用前均明显下降( P ( O 0 1 ) ，C Y P 2 C 1 9 * 2 * 2 突变型纯合子个体服
5、药后4 小 时、2 4 小时、3 天和7 天测定A D P 诱导的血小板聚集率明显高于C Y P 2 C 1 9 牛1 母1 野 生型个体( 分别为5 5 0 士5 3 ，5 2 1 士2 4 ，5 2 2 士5 2 ，5 2 9 士3 5 V S2 2 2 士3 8 ，2 1 2 士2 4 ，2 3 1 士4 5 ，2 1 2 士2 8 ，P 均 Aa n dl o w e rb l o c k i n d i c a t e s - 6 8 1 A A H a r d y i n b e r g 遗传平衡检验( 表1 ) 3 6 0 例男性体检志愿者中，C Y P 2 C 1 9 “ 2
6、基因6 8 1G G 型( C Y P 2 C i 9 * I * I 野生 型) 5 6 7 ，G A 型( C Y P 2 C 1 9 1 2 突变型杂合子) 3 53 ，A A 型( c Y P 2 c 1 9 2 + 2 突变型纯合子) 8 。经检验基因型分布频率观测值与预计值差异不显著，符合 H a r d y W e i n b e r g 遗传平衡( P O0 5 ) ，说明样本来自一个较大的、处于随机婚配 平衡状态的群体，具有一定代表性。 表1C Y P 2 C 1 9 + 2G 6 8 1 A 基因型的H a r d y - W e i n b e r g 遗传平衡检验 3
7、摘床试验 3 1 受试者入选标准； 选取1 8 名气虚血瘀体质志愿者( 其中C Y P 2 C 1 9 * I * I 野生型，C Y P 2 C 1 9 I 2 突变型杂合子和C Y P 2 C 1 9 2 2 突变型纯合子各6 名) ( 见表2 ) 进入临床研究。 入选标准为：受试者具有气虚体质特点，即形体消瘦或偏胖，体倦乏力，语声低 怯，常自汗出且动则尤甚，心悸食少，兼有血瘀体质特点，即面色晦滞，1 2 唇 色暗，眼睚暗黑，舌紫暗或有瘀点。整个实验方案得到了福建省立医院伦理委员 会的批准。受试者在参与临床试验前都签定了知情同意书。所有受试者实验前两 周及实验期间不能服用其它任何药物，实验
8、期间禁烟、酒及含咖啡等的饮料。 表2 受试者基本情况一览表 3 2 临床试验方案 临床试验在福建省立医院临床药理基地内进行，各有常规的急救药与急救 设备。试验聘请经过G C P 培训的一名医师与一名有多年工作经验的护士发药、静 脉采血和做相关记录，注意药物不良反应的发生。 受试者在第1 天清晨7 a m 空腹服用氯吡格雷3 0 0 m g ，第2 至第7 天清晨7 a m 空腹服用氯吡格雷7 5 m g 。( 第一天清晨空腹服用负荷剂量3 0 0 m g ，之后7 5 m g d ) ， 经洗脱期7 天后，单用脑心通( O 8 9 次，3 次天) 预处理5 天，之后继续服用 脑心通加氯吡格雷7
9、 天( 用法同上) 。分别在服药前0 小时及服用氯吡格雷后4 h 、 1 7 2 4 h 、3 天、7 天及洗脱期后第7 天、单用脑心通预处理后第5 天、合用后第7 天从前臂静脉采血3 m l 到3 8 枸橼酸钠抗凝管( 1 ：9 v v ) 。采血后2 小时内完 成测定血小板数、血小板聚集率( 比浊法、流式细胞法) 、C D 6 2 P ( 流式细胞法) 、 P A C 一1 ( 流式细胞法) 、s C D 4 0 L ( 酶联接免疫吸附剂测定法) 等血小板功能及炎性 指标。 氯吡格雷：S a n o f iW i n t h r o pI n d u s t r i e ，7 5 m g
10、粒，批准文号：进口药品注 册证号：H 2 0 0 8 0 2 6 8 ：进口药品分装批准文号：国药准字J 2 0 0 8 0 0 9 0 脑心通胶囊：咸阳步长制药有限公司，0 4 9 粒，批准文号：国药准字 Z 2 0 0 2 5 0 01 3 3 血小板聚集仪测定血小板聚集率 3 3 1 原理 当加入诱导剂A D P 后，血小板形态由片状转变为圆形，形成伪足，引起短暂 的光透过率的下降，然后由于血小板聚集，光透过率大幅度增加。光透过率增加 的速度和程度会被记录下来。 3 3 2 仪器及试剂 血小板聚集仪( 生产厂家：普利生公司：型号：L B Y N J 4 ) 诱导剂A D P ：S I G
11、 M A A L O R I C H 公司，美国。 标本：静脉血3 m l 3 3 3 操作方法 ( 1 ) 标本采集：用注射器( 粗针) 抽取静脉血2 m l 于枸橼酸钠抗凝管中( 至少 要采集l O m l 全血，先放入采血管2 m l ，最后将剩余血液弃掉或做它用) ，并顺序 编号，标本须在4 小时内完成检验，操作时应注意减少人工激活。 ( 2 ) 富血小板血浆( p l a t e l e t r i c h p l a s m a ，P R P ) 、贫血小板血浆( p l a t e l e t - p o o r p l a s m a ， P P P ) 及A D P 诱导剂应
12、用液制备： 1 ) P R P 制备：3 8 枸橼酸钠抗凝血3 m l 以7 0 0 r p m 离心四分钟，吸取上层血浆0 6 m l 于E P 管内。 2 ) P P P 制备：将去P R P 血浆的剩余全血于3 5 0 0 r p m 离心1 0 分钟，上清即为P P P 血浆。 3 ) 终浓度为5 m o l L 的A D P 诱导剂配N - 精确称取A D P 粉剂6 4 m g ，以5 m L 浓 1 8 度为o 9 的氯化钠溶液溶解，即为A D P 母液，其浓度为3 0 0 0 “m o l L ，分装后冻 存于- 2 0 。每次使用时以上述浓度的氯化钠溶液稀释至3 0 0 p
13、m o l L ，即为A D P 应用液。取5 乩以上溶度的A D P 应用液与3 0 0 p L 血小板血浆混合，A D P 诱导剂终 溶度即为5 H m o l L ，用后即弃。 4 ) 标本测定：将3 0 0 u l “P P P ”血浆加入比色杯内，插入比色孔( 透光面朝向检 验者) ，进行调零。取出比色杯，甩干杯内的血浆，加入3 0 0 u l “P R P ”血浆及 搅拌子一个，插入比色孔，按相应的序号键，屏幕显示：w a i t P R P 浓度( 数值) 一A D P 此时每个比色杯内各加入5 u l 的A D P 诱导剂( 加至比色杯底) 。每加一个 A D P 即按相应的序
14、号键开始检验。 5 ) 血小板聚集反应持续5 分钟，分析参数为最大的血小板聚集率。 3 4 流式细胞术测定血小板功能活性 3 4 1 原理 流式细胞仪具有能快速测定大量个体细胞的特性。样品中欲分析的细胞预先 进行荧光标记，然后由压缩氮经硅管送达标本室，再以50 0 0 - - - 一1 00 0 0 个细胞 秒的速率逐个射入光敏感区。在适当波长的激发光作用下，被特殊染色的细胞发 射出一定量的荧光脉冲讯号。探测器收集每个细胞的荧光讯号和光散射，然后传 入计算机进行分析。流式细胞术检测血小板功能活性主要是对血小板特异性膜糖 蛋白和活化标志物进行免疫荧光标记，用流式细胞仪测定荧光强度和特异性荧光 抗
15、体结合阳性的血小板百分率，来测定血循环中血小板的活化状态以及血小板对 激活剂的应答反应。改方法具有灵敏度高、特异性好、准确度高等优点，且操作 简单快速。 3 4 2 材料 ( 1 ) 多聚甲醛( P F A ) ：EM a r k e 产品，美国。 ( 2 ) A D P ： S I G M A - A L O R I C H 公司，美国。 ( 3 ) 3 8g L 枸橼酸钠抗凝剂。 ( 4 ) C D 6 1F I T C ：异硫氰酸荧光素标记的抗血小板G P l I I a 单克隆抗体( M c A b ) ： B e c t o n D i c k i n s o n 公司，美国。 (
16、5 ) P A C - 1F I T C ：异硫氰酸荧光素标记的抗血小板G PI Ib I I I a 上纤维蛋白原结 合位点抗体，即纤维蛋白原受体( F I B R ) 的M c A b ：B e c t o n D i c k i n s o n 公司，美 1 9 国。 ( 6 ) C D 6 2 PP E ：藻红蛋白标记的抗P 选择素的M c A b ： B e c t o n - D i c k i n s o n 公司， 美国。 ( 7 ) M o u s eI g MF I T C ：异硫氢酸荧光素标记的鼠抗人I g M ，B e c t o n D i c k i n s o n 公司，美国。 ( 8 ) M o u s eI g G ，P E ：藻红素标记的抗P 2 选择素的M c A b ，B e c t o n D i c
