《细胞培养基础知识讲解》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞培养基础知识讲解（24页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、细胞培养基础知识 细胞培养常用试剂 细胞污染的鉴别及清除 一、常用试剂 培基 血清 Hanks液 D-Hanks液 PBS EDTA 胰蛋白酶 青霉素、链霉素 培养基 根据培养基的来源及成分的明确程度来划分,其发 展大致可分为三个阶段: 1、天然培养基阶段(直接采用某些组织凝块、生 物性液体和组织提取液等作为细胞的培养基) 2、合成培养基阶段(如MEM、DMEM、RPMll640 、F12等) 3、无血清培养基阶段 血清 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) ：胎牛血清， CS (calf serum) ：小牛血清。 HS (horsese
2、rum)：马血清. 1. 保存血清最好的方法? 建议血清应保存在-5至-2O。然而，若存放于4时，请勿超过一个月 。若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再 放回冷冻。 2. 如何解冻血清才不会使产品质量受损? 建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于28冰箱使之融解，然后在室温 下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。 血清的主要作用在于向细胞提供激素(生化因子)、转移蛋白和其它营养物质等 3. 血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理? 血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的 变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血
3、清解冻后，也会存在于 血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。 但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可 以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基 内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会 阻塞您的过滤膜。 4. 为什么要热灭活血清? 加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细 胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养ES细 胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。 Hanks液与D-Hanks液 BSS与细胞生长状态下的pH值、渗透压及无 菌状态一致，
4、且配方简单，是组织培养基 本用液，常用于配制培养基及其他用液， 或洗细胞等，细胞在这种BSS中可生存几个 小时。 Hanks液是常见的平衡盐溶液(BSS)之一。 D-Hanks液则是无钙镁离子的Hanks液（也有 资料认为除了不含钙镁离子之外也不含葡 萄糖）。 Hanks液配方 Hanks液（原液） 原液甲： NaCl 160g KCl 8g MgSO47H2O 2g MgCl26H2O 2g 上述试剂加入800ml双蒸水。溶解。 CaCl2 2.8g溶于100ml双蒸水 上述二液混合，加双蒸水至1000ml，再加2ml氯仿防腐，4保存。 原液乙： Na2HPO412H2O 3.04g KH2
5、PO4 1.2g 葡萄糖 20g 加入800ml双蒸水，溶解。 0.4%酚红溶液 100ml 上述二液混合，加双蒸水至1000ml，再加2ml氯仿防腐，4保存。 使用时甲，乙原液按下列比例配成 Hanks 液 使用液：原液甲1份、原液乙1份、双蒸水18份滤过，20min灭菌，放4冰箱保存 ，使用前用NaHCO3调整pH值。 D-Hanks液配方 D-Hanks液 NaCl 4.5g KCl 0.2g NaHCO3 0.175g Na2HPO412H2O 0.076g KH2PO4 0.03g 葡萄糖 0.5g 0.4%酚红 2.5ml 将上述成分依次溶解或加入到双蒸水中，最 后加双蒸水定容至5
6、00ml，以5.6%NaHCO3调整 pH 值至7.4，4冰箱保存备用。 酚红在低pH值时呈现黄色,在pH6.6至8.0间 会呈现橙色，在高pH值时呈现红色。 酚红只是起指示酸碱度的作用，有酚红较 方便但没有也无妨。有人主张最好不用酚 红，可能对细胞生长不利，有时也会影响 一些检测结果。 此外酚红有雌激素样作用，所以如果做相 关的实验最好不加。 对于Hanks与D-hanks液的配制，不同的文 献有不同的配方 我们可以看到，两者最主要的区别就是D- hanks液中没有钙镁离子。 Hanks液与D-Hanks液 用途上的比较 Hanks液是组织培养基本用液，常用于配制 培养基及其他用液，或洗涤组
7、织、细胞等 。细胞在Hanks液中可以在一段时间内维持 一定的活力。另外Hanks液还可以用于终止 EDTA的作用。 配制胰酶液或者是胰酶/EDTA的基础液都是 D-hanks 液，而不能使用Hanks液。 这是由 于钙离子和镁离子会影响胰蛋白酶的活性 ，也会阻碍EDTA的作用。 PBS与Hanks液的用途区别 PBS：磷酸缓冲盐溶液具有pH缓冲作用的等渗 盐溶液。多用于非活体。 Hanks：平衡盐溶液无机盐和葡萄糖浓度接 近大部分动物（植物）细胞的水平，可作为动（ 植）物细胞短期培养（保存）。多用于活体。 Hanks液中盐成分较PBS复杂，且有葡萄糖，可为 细胞提供简单的营养，而PSB中只有
8、磷酸根，钠， 钾，氯离子，只是最简单的盐平衡缓冲液，不能 为细胞提供暂时的营养。 EDTA与胰蛋白酶 EDTA，常用的阳离子螯合剂。 组织细胞间存在钙黏蛋白（一类Ca2+依赖 的细胞黏着糖蛋白 ）。而EDTA可以通过螯 合金属离子，破坏Ca2+或Mg2+依赖性的细胞 黏着。 胰蛋白酶 水解细胞间的蛋白质，方便形成细胞悬液 。 消化细胞时可以只使用胰蛋白酶，也可以 胰蛋白酶与EDTA同时使用。 胰蛋白酶的消化作用可以通过加入血清终 止。 EDTA的作用可以通过加入Hanks液终止。 青霉素与链霉素 一般合称双抗。 青霉素主要对革兰氏阳性菌有效。 链霉素对许多革兰阴性杆菌作用良好。 细胞的污染及清
9、除 细胞培养最怕污染，要控制细菌、霉菌污染 ，必须对细胞培养的每一个环节都认真对待 。对于细菌污染，常用的抗生素有庆大霉素 、阿米卡星等，霉菌污染，则可用制霉菌素 。 细胞污染的鉴别及清除 真菌污染 细菌污染 支原体污染 其他 真菌污染 烟曲霉、黑曲霉、毛 霉菌、孢子霉、白念 珠菌、酵母菌等 霉菌污染后培养液是 清亮的，多数在培养 液中形成白色或浅黄 色漂浮物。一般肉眼 可见，丝状、管状、 及树枝状菌丝悬浮飘 荡在培养液中。 预防：培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体；用硫酸铜溶液擦 拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜 防治：可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放
10、线菌素D或双抗； 但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建 议舍弃该污染细胞。 细菌污染 细菌污染较易发现，多数情况下培养液短 期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生， 出现明显混浊现象。倒置显微镜下观察，可 见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。 支原体污染 支原体是牛血清中最常见 的微生物之一，黑色的， 好象多为多形，培养液一 般会浑浊。 不能用过滤的办法除去 其他污染 黑蛟虫：低倍下为黑色点状，高倍 下可看见黑色的小虫游来游去，培 养液也是不浑的，一般不会太影响 ，细胞还是可以用的。对细胞生长 状态不会有明显影响，在细胞增殖 旺盛之后会自然消失，除更换血清 外无须特殊处理。如果细胞有可能 是此种污染的话，可以增加细胞的 种板密度，以提高细胞的生存率。 污染的预防 从物品、用品消毒 添加抗生素：联合应用比单用效果好 从操作者做起 抗生素抗菌谱浓度（量 /mL） 细菌真菌支原体 青霉素G+ 100 1000u 链霉素G- 100 1000g 庆大霉素G+ /G- +50200g 四环素G+ /G- +1050g 卡那霉素G+ /G- + 100 1000g 两性霉素 + 常用 2g/mL 制霉菌素 + 常用 25g/mL +表示效应程度 常用抗生素用量和效应 谢谢！
