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1、乙酰胆碱受体亚基97-116肽段制作实验性重症肌无力模型的研究 作者：胡任飞，宋雅芳*，刘友章，李良龙，黄晓燕，陈裕杲，姬爱冬， 张久梅【摘要】 目的研究用乙酰胆碱受体亚基97-116肽段制作实验性重症肌无力(EAMG)的动物模型。方法给实验组Lewis鼠皮下注射人工合成的鼠源性乙酰胆碱受体亚基97-116肽段，观察接种后大鼠一般情况及体重、Lennon评分变化，应用低频重复电刺激检测电衰减反应，并与对照组鼠比较。结果模型组大鼠在第1次强化免疫后逐渐出现肌无力症状，体重增长缓慢或下降，甚至消瘦，毛发变得暗淡、粗糙甚至脱落，再次加强免疫后上述症状明显加重。Lennon临床评分29只评分在1级以上
2、，并行RNS检测，36只模型鼠中32只5 Hz重复刺激电衰减率>10%，而对照组衰减率均<10%，两组比较差异有显著性(P<0.01)。结论皮下注射鼠源性乙酰胆碱受体亚基97-116肽段可成功制作实验性自身免疫性重症肌无力大鼠模型。 【关键词】 重症肌无力; 乙酰胆碱受体; 亚基; 肽段重症肌无力(Myasthenia gravis, MG)是乙酞胆碱受体抗体(AchR-Ab)介导的、细胞免疫依赖和补体参与的一种自身免疫性疾病，病变主要累及神经肌肉接头处突触后膜乙酰胆碱受体，导致神经肌肉接头处传递功能障碍。用从电鳗电器官中提取的AchR作为免疫原主动免疫易感鼠来建立EAMG模
3、型，这是经典的造模方法。电鳗的电器官中含有丰富的AchR，但不足之处是电鳗难以捕获且提纯过程复杂，代价昂贵，限制了该法的大规模应用。本研究采用鼠源性乙酰胆碱受体亚基97-116肽段作为免疫原接种Lewis大鼠，制作EAMG模型，观察大鼠肌无力的变化，为研究重症肌无力的发病机制和治疗提供一种较好的实验动物模型。1 材料1.1 动物SPF级8周龄的Lewis大鼠45只，雌性，平均体重(155.2415.77)g，在自然环境条件下饲养;由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号码：SCXK-(京)2007-0001。随机取6只作为对照组(A组)，剩余大鼠进行EAMG造模，第6周末，造模大鼠还剩
4、36只，经肌电图检测后，确定成模32只。再将其随机分为模型组、强的松组、健脾祛湿方高剂量组(相当于成人剂量的16倍)、健脾祛湿方低剂量组(相当于成人剂量的8倍)，分别为B、C、D、E组，每组各8只，共5组。1.2 试剂鼠源性AchR-亚基97-116肽段序列(the rat sequence 97-116 of the AchR subunit,R97-116)：DGDFAIVKFTKVLLDYTGHI，由西安美联生物技术有限公司合成。完全福氏佐剂(complete freunds adjuvant，CFA)、不完全福氏佐剂(incomplete freunds adjuvant，IFA)、磷
5、酸缓冲液(Phosphate Buffer Solution，PBS)均购自美国Sigma公司;新斯的明、阿托品均由广州中医药大学第一附属医院药剂科提供。2 方法2.1 EAMG模型建立本实验造模方法参考Baggi等1和许文华等2的制备方法复制EAMG模型。具体方法：首先将R97-116、CFA、PBS三者按11.51.5的比例充分混匀制成免疫乳剂;首次免疫：取乳剂200 l(含R97-116100 g)于造模鼠足垫、腹部、背部多点皮下注射，对照组皮下注射等量PBS;首次免疫后30 d及45 d，将R97-116、IFA、PBS三者按133的比例充分混匀制成免疫乳剂后，再取乳剂200 l(含R
6、97-11650 g)强化接种，对照组同样注射等量PBS。2.2 模型评估标准2.2.1 临床评估临床评估：通过测量体重和肌力来评价疾病严重性。实验前及接种后每周2次称重。末次免疫2周后观察其摄食、姿势及活动情况。测量肌力(对于轻度肌无力者给予疲劳试验即让鼠重复抓握笼顶30 s再测量)：采用Lennon等3的分级法予以临床评分;肌力具体分级为：0级：没有肯定的肌无力表现;1级：撕咬无力，四肢力量差，在光滑地面上前肢打滑，活动减少，且容易疲劳;2级，明显无力，在抓握前就出现震颤、低头、隆背、抓握力弱;3级，在抓握前即有严重的肌无力表现、无力抓握、濒死状态;4级，死亡。动物症状在以上4者之间可分别
7、以0.5，1.5，2.5计分。结果以每个时间点的平均数表示。2.2.2 新斯的明试验4用腹腔注射法给予新斯的明(37.5 g/kg)和硫酸阿托品(15 g/kg)，12 min后大鼠肌无力症状可缓解，持续212 h。2.2.3 RNS检测电衰减反应5,6以10%的水合氯醛350 mg/kg 腹腔注射麻醉后，将鼠仰卧固定在泡沫垫上。将刺激电极插入坐骨神经附近肌肉内，参考电极插入腹部皮下，记录电极一根置于同侧腓肠肌内侧头， 另一根插入跟腱部皮下，给予5 Hz连续10次的低频电刺激，将第1与第5个动作电位的变化百分比作为衰减值D，衰减率大于10%者为阳性。3 结果3.1 一般情况从第1次开始免疫后，
8、造模大鼠约1月后才逐渐开始出现症状，如活动减少，动作减慢，抓持时挣扎力量减弱，叫声降低或短促，体重增长缓慢或下降，甚至消瘦，毛发变得暗淡、粗糙甚至脱落，再次免疫后上述症状加重。最后共死亡3只，其中2只因肌无力症状过重而死亡，1只因皮下注射点出血，被同笼其它大鼠咬伤致死。3.2 造模期间大鼠体重变化情况开始造模后，对照组大鼠体重保持稳定的增长趋势，而模型组体重增长较慢，且在加强免疫后体重出现下降，特别是在第6周再次加强免疫后体重出现明显的下降趋势。结果见图1。图1 造模期间EAMG大鼠体重变化3.3 造模期间大鼠Lennon评分分级变化情况模型组实验鼠大多在初次免疫4周后出现较明显的肌无力，Le
9、nnon临床评分达0.51级，且随着时间的延长肌无力症状愈加显著，至造模结束时临床评分在1级以上者占造模鼠的78.38%。而对照组仅有个别在初期出现可疑的肌无力表现，至造模结束时评分均为0级。结果见图2。图2 造模期间EAMG大鼠Lennon评分变化3.4 末次免疫2周后RNS检测结果应用5Hz连续10次的低频电刺激检测36只造模实验鼠，共有32只大鼠第1与第5个电位的衰减百分比超过10%，平均为(20.424.45)，其余4只大鼠的电衰减率小于10%，而对照组最大衰减均不超过10%。结果见表1及图3、4。表1 两组应用5Hz重复电刺激电衰减率比较图3 正常鼠电衰减图图4 成模鼠电衰减图x【摘
10、要】 目的研究用乙酰胆碱受体亚基97-116肽段制作实验性重症肌无力(EAMG)的动物模型。方法给实验组Lewis鼠皮下注射人工合成的鼠源性乙酰胆碱受体亚基97-116肽段，观察接种后大鼠一般情况及体重、Lennon评分变化，应用低频重复电刺激检测电衰减反应，并与对照组鼠比较。结果模型组大鼠在第1次强化免疫后逐渐出现肌无力症状，体重增长缓慢或下降，甚至消瘦，毛发变得暗淡、粗糙甚至脱落，再次加强免疫后上述症状明显加重。Lennon临床评分29只评分在1级以上，并行RNS检测，36只模型鼠中32只5 Hz重复刺激电衰减率>10%，而对照组衰减率均<10%，两组比较差异有显著性(P<
11、;0.01)。结论皮下注射鼠源性乙酰胆碱受体亚基97-116肽段可成功制作实验性自身免疫性重症肌无力大鼠模型。 【关键词】 重症肌无力; 乙酰胆碱受体; 亚基; 肽段重症肌无力(Myasthenia gravis, MG)是乙酞胆碱受体抗体(AchR-Ab)介导的、细胞免疫依赖和补体参与的一种自身免疫性疾病，病变主要累及神经肌肉接头处突触后膜乙酰胆碱受体，导致神经肌肉接头处传递功能障碍。用从电鳗电器官中提取的AchR作为免疫原主动免疫易感鼠来建立EAMG模型，这是经典的造模方法。电鳗的电器官中含有丰富的AchR，但不足之处是电鳗难以捕获且提纯过程复杂，代价昂贵，限制了该法的大规模应用。本研究采
12、用鼠源性乙酰胆碱受体亚基97-116肽段作为免疫原接种Lewis大鼠，制作EAMG模型，观察大鼠肌无力的变化，为研究重症肌无力的发病机制和治疗提供一种较好的实验动物模型。1 材料1.1 动物SPF级8周龄的Lewis大鼠45只，雌性，平均体重(155.2415.77)g，在自然环境条件下饲养;由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号码：SCXK-(京)2007-0001。随机取6只作为对照组(A组)，剩余大鼠进行EAMG造模，第6周末，造模大鼠还剩36只，经肌电图检测后，确定成模32只。再将其随机分为模型组、强的松组、健脾祛湿方高剂量组(相当于成人剂量的16倍)、健脾祛湿方低剂量组(相
13、当于成人剂量的8倍)，分别为B、C、D、E组，每组各8只，共5组。1.2 试剂鼠源性AchR-亚基97-116肽段序列(the rat sequence 97-116 of the AchR subunit,R97-116)：DGDFAIVKFTKVLLDYTGHI，由西安美联生物技术有限公司合成。完全福氏佐剂(complete freunds adjuvant，CFA)、不完全福氏佐剂(incomplete freunds adjuvant，IFA)、磷酸缓冲液(Phosphate Buffer Solution，PBS)均购自美国Sigma公司;新斯的明、阿托品均由广州中医药大学第一附属医
14、院药剂科提供。2 方法2.1 EAMG模型建立本实验造模方法参考Baggi等1和许文华等2的制备方法复制EAMG模型。具体方法：首先将R97-116、CFA、PBS三者按11.51.5的比例充分混匀制成免疫乳剂;首次免疫：取乳剂200 l(含R97-116100 g)于造模鼠足垫、腹部、背部多点皮下注射，对照组皮下注射等量PBS;首次免疫后30 d及45 d，将R97-116、IFA、PBS三者按133的比例充分混匀制成免疫乳剂后，再取乳剂200 l(含R97-11650 g)强化接种，对照组同样注射等量PBS。2.2 模型评估标准2.2.1 临床评估临床评估：通过测量体重和肌力来评价疾病严重
15、性。实验前及接种后每周2次称重。末次免疫2周后观察其摄食、姿势及活动情况。测量肌力(对于轻度肌无力者给予疲劳试验即让鼠重复抓握笼顶30 s再测量)：采用Lennon等3的分级法予以临床评分;肌力具体分级为：0级：没有肯定的肌无力表现;1级：撕咬无力，四肢力量差，在光滑地面上前肢打滑，活动减少，且容易疲劳;2级，明显无力，在抓握前就出现震颤、低头、隆背、抓握力弱;3级，在抓握前即有严重的肌无力表现、无力抓握、濒死状态;4级，死亡。动物症状在以上4者之间可分别以0.5，1.5，2.5计分。结果以每个时间点的平均数表示。2.2.2 新斯的明试验4用腹腔注射法给予新斯的明(37.5 g/kg)和硫酸阿托品(15 g/kg)，12 min后大鼠肌无力症状可缓解，持续212 h。2.2.3 RNS检测电衰减反应5,6以10%的水合氯醛350 mg/kg 腹腔注射麻醉后，将鼠仰卧固定在泡沫垫上。将刺激电极插入坐骨神经附近肌肉内，参考电极插入腹部皮下，记录电极一根置于同侧腓肠肌内侧头， 另一根插入跟腱部皮下，给予5 Hz连续10次的低频电刺激，将第1与第5个动作电位的变化百分比作为衰减值D，衰减率大于10%者为阳性。3 结果
