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1、扇贝糖胺聚糖对型单纯疱疹病毒的抑制作用 作者：于囡 刘赛 韩建建 孙福生 【摘要】 目的 研究扇贝裙边糖胺聚糖(SSGAG)不同浓度及不同作用时间对型单纯疱疹病毒(HSV)的抑制作用。方法 以HSV SM44株感染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞),观察病毒感染后的细胞变性反应（CPE）,并检测不同浓度SSGAG及不同作用时间对HSV复制的抑制作用。结果 与病毒对照组相比，SSGAG各浓度组（100、50、25 mg/L）能有效保护经HSV感染的Vero细胞，使细胞活性增强（F=27.54,P<0.01）；并减弱HSV导致的病变效应，抑制病毒的复制，并且随着药物作用时间的延长，药物抗病毒效应
2、逐渐增加， 最高达88.64%。结论 SSGAG体外具有明显的抗HSV1病毒作用。 【关键词】 糖胺聚糖 扇贝裙边 疱疹病毒型 人 ABSTRACT Objective To study the inhibitory effect of glycosaminoglycan from scallop skirt (SSGAG), in different time and concentration,on type herpes simplex virus (HSV). Methods The Vero cells were infected by HSV SM44, and their deg
3、eneration then observed.The inhibitory effect of SSGAG, in different concentration and time, on replication of HSV was detected. Results Compared with the virus control group, SSGAGtreated group could protect the Vero cells effectively and heighten the cell activity (F=27.54，P<0.01), and could le
4、ssen the cytopathic effect induced by HSV1 and inhibit virus replication. The antiviral effect increased along with the prolongation of drug used, the ER% could reach the highest of 88.64%. Conclusion SSGAG shows siginificant activity of protecting host cell and antiviral effect against HSV1 in vitr
5、o. KEY WORDS Glycosaminoglycan; Scallop skirt; Herpesvirus 1, human 单纯疱疹病毒(HSV) 属疱疹病毒科, 为DNA 病毒, 其病毒基因组由一线形的双股DNA 分子构成。型人类单纯疱疹病毒可引起唇疱疹、疱疹性角膜结膜炎、新生儿脑炎等多种疾病，目前尚无有效疫苗用于预防。临床应用的抗病毒药物毒性大，加之毒株的变异容易产生耐药性，因此，筛选研制新的抗病毒药物就尤为重要。近年来，随着海洋生物资源的开发，人们发现了许多具有独特生物活性的海洋生物多糖。扇贝裙边糖胺聚糖(SSGAG)是从海洋贝类扇贝裙边中提取、纯化得到的酸性黏多糖(即硫酸多
6、糖)。据文献报道，动物体内的硫酸多糖具有多种药理活性，如抗凝血、降血脂、抗病毒及增强免疫功能等，已引起人们对这类生物高分子的高度重视1，2。本实验以非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)为宿主细胞，通过细胞培养法对扇贝裙边糖胺聚糖（SSGAG）在不同剂量及不同给药时间其体外抗型单纯疱疹病毒（HSV）的作用进行了初步研究。现报告如下。 1 材料与方法 1.1 实验材料 SSGAG为青岛大学医学院药理教研室扇贝糖胺聚糖课题组提供的粉剂，实验时用无血清DMEM培养基配成不同浓度的溶液；DMEM干粉培养基为Hyclone公司产品;胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）为杭州四季青生物工程材料
7、有限公司产品；胰蛋白酶为AMRESCO公司产品；乙二胺四乙酸二钠（EDTA）由青岛海泰生物技术有限公司分装；酸性异丙醇为上海亨达化学试剂有限公司产品；四甲基偶氮唑蓝（MTT）为Sigma公司产品。TC 2323型CO2培养箱为美国FormaScientific公司产品;XDP1型倒置显微镜为日本Olympus公司产品;ELx 800型酶联免疫检测仪为美国BioTek公司产品;细胞培养板为Costar公司产品;超净工作台为苏净集团安泰公司产品。标准单纯疱疹病毒型(HSV) SM44株由中国协和医科大学提供。HSV在Vero细胞中传代，毒种于-80 保存。SSGAG (青岛大学医学院药理学教研室提
8、供)使用前用无血清DMEM培养液稀释到所需浓度。实验分为正常细胞对照组、病毒对照组、SSGAG各浓度组（100、50、25 mg/L）。 1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养 Vero细胞由农业部动物检疫所惠赠。于DMEM高糖基础培养液中加入体积分数0.10的小牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/L链霉素，置体积分数为0.05的CO2孵箱中37 常规培养。 1.2 观察指标测定 1.2.1 病毒毒力测定3 用病毒的致50%组织培养感染量（TCID50）表示病毒毒力。 将Vero细胞接种于无菌96孔板,长成单层后，将HSV病毒原液进行连续10倍递次稀释,稀释度为10-110-9，每孔
9、接种上述系列稀释度的病毒稀释液100 L,于37 吸附1.5 h后换维持液继续培养,每个稀释度设6个复孔,并设6孔正常细胞对照。每日在倒置显微镜下观察细胞病变（CPE）。CPE达50%以上计为病变孔，记录病变程度和孔数,待细胞病变稳定后，判定结果。记录标准：CPE 0%为“-”；CPE 1%25%为“+”；CPE 26%50%为“”；CPE 51%75%为“”；CPE 76%100%为“”。根据ReedMuench法计算病毒的TCID50。 1.2.2 SSGAG对HSV复制的抑制作用 将100 TCID50 HSV病毒液接种到单层Vero细胞孔中,每孔100 L，37 吸附1.5 h,弃去病
10、毒液更换含有不同浓度的SSGAG（100、50、25 mg/L）维持液，每孔200 L,继续培养72 h,每日在倒置显微镜下观察CPE并记录结果。记录标准同上。同时设病毒对照组、正常细胞对照组，每组设6个复孔。72 h后，当病毒对照组细胞病变达75%以上时，应用MTT法测吸光度（A）值，并计算药物抗病毒有效率(ER%)。ER%=(药物组的平均吸光度值-病毒对照组的平均吸光度值)/病毒对照组的平均吸光度值100%。 1.2.3 SSGAG的不同作用时间对病毒的抑制效应 将一定量病毒液（100 TCID50HSV）攻击单层Vero细胞孔,每孔100 L，37 孵育2 h后,弃去病毒液换含浓度为10
11、0 mg/L的SSGAG维持液，每孔200 L, 于含体积分数0.05 CO2孵育箱中37 分别培养12、24、48、72 h后，换为不含药的DMEM维持液，每日在倒置显微镜下观察CPE并记录结果。记录标准同上。同时设病毒对照组、正常细胞对照组，每组设6个复孔。72 h后，当病毒对照组细胞病变达75%以上时，MTT法测吸光度值，并计算ER%。 1.3 统计学处理 数据以s表示，采用SPSS 12.0软件对数据进行分析，多个均数间比较采用方差分析,然后进行两两比较的q检验。 2 结果 2.1 病毒毒力测定 按ReedMuench法测得病毒TCID50为10-4.7。实验用病毒浓度为100 TCI
12、D50。 2.2 SSGAG对HSV复制的抑制作用 与正常细胞对照组细胞相比较，病毒对照组细胞出现典型的CPE特征，细胞增殖活性明显减弱（P<0.01）。与病毒对照组相比，SSGAG各浓度组细胞的肿胀、变圆、脱落、碎裂等典型CPE特征明显减弱，细胞活性增强（P<0.01），药物抗病毒有效率达50以上；而且随着药物浓度的增加, 作用逐渐增强，但SSGAG各浓度组间细胞活性均无显著性差异（P>0.05）。见表1。 2.3 SSGAG不同作用时间对病毒的抑制效应 病毒对照组细胞同样出现典型的CPE特征，细胞增殖活性明显低于正常细胞对照组（P<0.01）。与病毒对照组相比，SS
13、GAG在作用24、48、72 h后的细胞肿胀、变圆、脱落、碎裂等典型CPE特征明显减弱，细胞增殖活性增强（P<0.01），并与正常细胞对照组细胞增殖活性无明显差别，而且随着药物作用时间的延长, 保护作用逐渐增强。其中当药物作用72 h时，药物抗病毒有效率达88.64%。见表2。 3 讨论 疱疹病毒科是属于有包膜的线状双链DNA病毒,它广泛存在于自然界中。目前临床应用的抗病毒药物有20多种,其中23种为核苷类衍生物,其作用靶点均为病毒复制过程中的关键酶,如DNA合成酶。这些药物的缺点或是抗病毒谱窄,易产生耐药毒株,或是毒副作用大,价格昂贵,或是药理特性不理想4。因此，研究抑制病毒基因复制、
14、转录及转译等多环节的药物和制剂是当今国内外开发抗病毒药物的热点。近几年来，在寻找有效抗病毒药物的过程中，不断发现有多种多糖对病毒有抑制作用，其中抗病毒多糖中研究最多的是硫酸多糖，包括从植物中提取的各种硫酸多糖、肝素、天然中性多糖的硫酸衍生物及人工合成的各种硫酸多糖。硫酸多糖具有广泛的生物学活性,包括抗病毒、抗肿瘤、对免疫系统作用和抗凝活性5。早在40年前就已知硫酸多糖具有抗病毒活性，1964年NAHMIAS等6报道肝素对HSV有抑制作用,但没有引起人们的重视,当时认为这种作用是非特异性的。直到20世纪80年代末研究发现，几种聚阴离子物质是HIV复制的有效抑制剂,从而引起人们对硫酸多糖抗病毒作用
15、研究的兴趣。 表1 SSGAG对HSV1复制的抑制作用（略） 与病毒对照组相比，F=27.540,q=3.956.58,P<0.01；与正常细胞对照组相比，*q=10.15,P<0.01 表2 SSGAG不同作用时间对病毒的抑制效应（略） 与病毒对照组相比，F=13.39，q=3.045.30,P<0.01；与正常细胞对照组相比，*q=6.43,P<0.01 扇贝是一种海产贝类，属于软体动物门、扇贝科。从古到今它都是一种深受欢迎的营养保健品，具有滋阴补肾调中的功效。扇贝裙边糖胺聚糖(SSGAG) 是从栉孔扇贝裙边中提取纯化的硫酸多糖成分,属于天然药物，细胞毒性小，理化性质与肝素相似7。本文的研究结果表明，SSGAG在体外对HSV的复制有抑制作用，能有效地保护细胞，减弱了细胞的感染程度，而且随着药物作用时间的延长，抗病毒效应也增强。 一般认为,多糖抗病毒机制是对病毒复制早期阶段进行抑制,即抑制病毒向细胞表面的吸附。病毒结合多糖通过对被侵染细胞外部作用而抑制蚀斑形成,这一观点被绝大多数病毒学家所接受。近些年的研究显示,细胞表面的硫酸类肝素蛋白多糖是HSV、HSV、假性狂犬病病毒、牛疱疹病毒的起始受体
