《苏云金杆菌晶体中20kb+dna与质粒及染色体的序列相关性研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《苏云金杆菌晶体中20kb+dna与质粒及染色体的序列相关性研究（64页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、湖南师范大学 硕士学位论文 苏云金杆菌晶体中20-kb DNA与质粒及染色体的序列相关性研究 姓名：付祖姣 申请学位级别：硕士 专业：微生物学 指导教师：夏立秋 20040501 以此为探针分别与质粒和染色体的酶切片段进行s o u t h e m 杂交。杂交结果 显示在B t4 0 7 1 8 的质粒和染色体均存在c 秒基因。 3 B t4 0 7 1 8 菌株染色体上c 基因的鉴定 采用脉冲电泳分离B t4 0 7 1 8 菌株的染色体，将染色体D N A 带从凝胶 上切下，利用透析袋电洗脱法回收染色体D N A ，经& 酶切后作为模板， 进行p c R 扩增。首先利用c w j 、c r
2、 注基因的通用引物进行检测，获得预期 的2 7 7 b p 和6 8 9 b p 的P C R 产物。随后用c r y J 、c r y 2 基因的特异引物进行P C R 扩增，分别获得1 6 0 0 b p 与1 2 0 0 b p 左右的P C R 产物。对其进行限制片段长 度多态性( R F L P ) 分析表明，B t4 0 7 1 8 菌株染色体上含有c 埽J 爿口、c w j 4 c 、 c 砂捌口、c r ) ，脚6 基因。 关键词：苏云金芽孢杆菌，2 0 k bD N A ，染色体，质粒，s o u t h e m 杂交， P C R R F L P A B S T R A C
3、 T T h r o u 曲c l o n i n g a n d e x p r e s s i o n o fc 秽埘c g e n e o n2 0 一k bD N Ai n b i p ”锄i d a lc r y s t a l s 疗o mB 叩f “J 砌“r 以雪地淞括s 仃a i n 4 0 718 ，t h i s s t u d y t e s t m e dt h a t2 0 k bD N Ac o n t a i n e dt h ec o d i n gs e q u e n c e so fc r y s t a lp r o t e i n s I n o r
4、 d e rt o e x p l o r et h eo r i g i n o fm e2 0 k bD N A 矗a g m e m ，t h es t u d yd e t e c t e d d i s 订i b u t i o no f c 秽一t y p eg e n e s o n p l a s m i d a I l dc l r o m o s o m eo fB 口c 订，“s 胁甜，f 胛g 据珊括s t r a i n4 0 7 18b ym e a n so fS o u t h e m b l o t t i n g T h ee X i s t e n c e
5、o f t h e s a m ec 一t y p eg e n e so np l a S m i da n dc h r o m o s o m e ，a sm a to n2 0 一k bD N Ai n b i p y r a m i d a lc r y s t a l s f r o mB ts t r a i n4 0 718 ，r e n d e r e dd i r e c te V i d e n c e st ot h e p r e v i o u ss p e c u l a t i o n t h a t2 0 - k bD N Ao nc r y s t a l
6、sf r o m B 崩“r 办喈把门s 括w a s d e r i v e df o mD 1 a s m i d so rc h r o m o s o m e 1 C I o n i n ga n de x p r e s s i o no fc ，y J 爿cg e n eo n2 0 一k bD N A i n b i p y r a m i d a l c r y s t a l sf r o mB ts t r a i n4 0 7 1 8 A p a i ro fp r i m e r sw e r ed e s i g n e dt oa r I l p l i 匆4 2
7、一k bf a g m e mc o n t a i n i n gm e p r o m o t e r ，t h ec o d i n gr e g i o na n dt h et e n n i n a t o ro fc r ) ，J 4 cg e n eo n2 0 一k bD N A T h eP C R p r o d u c tw a ss u b c I o n e di n t op M D 18 一Tv e c t o rt h m u g hT ，A 1 i g a t i o n T h er e s u l t a n tr e c o m b i n a m p
8、 T A c 4 w a s d i g e s t e dw i t hB 口，坍I a n ds 口，I T h e nt h e 4 2 一k b d i g e s t e df h g m e n tw a sc l o n e d i n t oB t E c D ，fs h u t t l ev e c t o rp H T 3 0 4 ， p r o d u c i n gp H A c 4 T h ep l a S m i dp H A c 4w a s 订a n s f o n I l e di n t oa c r y s t a l l i f e r o u s s
9、t r a i nX Z M 一1 0 l b ye l e c t r o p o r a t i o n T h ee x p r e s s i o n o f c 叫4 cg e n e i n t r a n s f o n n a n t x z M - 1 0 l p H A c 4w a sm o n i t o r e db yA F Mo b s e r v a t i o n a n d S D S P A G Ea n a l y s i s T y p i c a l b i p y r 啪i d a lc r y s t a l sw a so b s e r v
10、e du n d e rA F M a n d1 3 0 一k D p r o t e i nb a n d o nS D S P A G Eg e l sw a s f o u n d B i o a s s a y r e s u l t s s h o w e dt r a n s f o r m a n tc o n t a i n i n gp H A c 4w a st o x i c a g a i n s tp 觑艟，肠砂肠J 把Z 肠 1 a r v a e 2 L o c a I i z a t i o no f c ，yg e n e s i nB ts t r a i
11、n4 0 7 1 8 C h r o m o s o m eo fB ts 仃a i n4 0 718w h i c hw a sd i g e s t e dw i t h i na d v a n c e w a s s u b j e c t e d t o p u l s e d n e l dg e le l e c t r o p h o r e s e s ( P F G E ) T h e d i g e s t e d c h r o m o s o m ea n dp l a s m i d 8o fB ts t r a i n4 0 7l8w e r e 订a n s f
12、 e r r e dt oh y b o n d N + n y l o nm e m b r a n e sr e s p e c t i v e l y ，柚dw e r eb l o 仳dw i t ht h eD I G - 1 a b e l e dp r o b e t h a tw a sd e r i v e df r o m1 6 一k bP C R f r a g m e n tf r o mc ，y ，爿cg e n e T h er e s u l t so f s o u t h e m b l o t t i n gs h o w e d t h a tb o t
13、hp l a s m i da n dc l r o m o s o m eo f B ts t r a i n4 0 7 1 8 h a r b o r e d c 秽一t y p eg e n e s 3 I d e n t m c a t i o no f c 侈一略p eg e n e s o nc h r o m o s o m ef r o mB ts t r a i n4 0 7 1 8 P F 。G Ew a su s e dt os e p a r a t cc l l r o m o s o m ef r o mo 廿1 e rD N Ae l e m e n t so f
14、B t s t r a i n4 0 7 1 8 ，T h e nc h r o m o s o m a lD N Aw a sr e c o V e r e d 仔o m g e l s l i c e s b y e l e c 仃o e l u t i o n 1 w op a i r so f u n i V e r s a l p r i m e r sU n l ( d ) U n l ( r ) a n dU n 2 ( d ) 九J n 2 ( r ) w e r eu s e dt od e t e c t c 秒一哆p eg e n e s o nc h r o m o s
15、 o m ea R e rt h er e c o v e r e d c 1 1 r o m o s o m a lD N Aw a s d i g e s t e dw i t h5 矗n T w oP C Rp r o d u c t sw i t hp r e d i c t e d s i z e so f 2 7 7 b pa n d6 8 9 b p w e r eo b t a i n e d F o rR f L P a n a l y s i so fc ，) ，J a n dc ，) ，2 g e n e s ，t w op a i r so fs p e c i f i
16、 cp r i m e r sw e r eu s e df 0 rP C R a m p l i f i c a t i o n 16 0 0 - b p P C R p r o d u c tc o r r e s p o n d i n gt oc 秒Jg e n e sa m p l i 矗e dw i t hk 5 u n 2 瓜3 u n 2w a s d i g e s t e dw i t hn f I a n d j 国口I 1 2 0 0 - b pP C Rp r o d u c tc o r r e s p o n d i n g t oc 砂2g e n e s a m p l i n e d w i t hS 5 u n 2 ，S 3 u n 2w a s d i g e s t e dw i t h 胁玎c I Ia n d 。 ! l 印I T h er e s 仃i c t i o n f h g
