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1、华中科技大学 硕士学位论文 脱氢表雄酮对高脂诱导的兔主动脉及人脐静脉内皮细胞VCAM- 1表达的影响 姓名：周颖 申请学位级别：硕士 专业：病理和病理生理学 指导教师：阮秋蓉 20070401 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 II 中 文 摘 要中 文 摘 要 动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是一种慢性炎症性疾病，细胞因子、黏附 分子及趋化因子均参与了AS的病理过程。 高脂血症等各种危险因素可引起动脉管腔 内皮细胞的功能紊乱，诱导内皮细胞及平滑肌细胞表达血管细胞黏附分子（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）等细胞因子，从而
2、促使循环的单核细胞黏附于内 皮，并迁入内皮下间隙，分化成巨噬细胞，巨噬细胞大量摄取脂质而最终转化成泡 沫细胞，形成早期AS的主要特征。由此可知，黏附分子在AS发生发展过程中起着 重要作用。因此，降低AS相关细胞黏附分子的表达有可能阻止或减慢AS的发生。 脱氢表雄酮( Dehydroepiandrosterone,DHEA) 是雄激素的前体，少量转化为 雌激素。 DHEA从出生后分泌不断增多，至青春期达到顶峰，随后随着年龄的增长 而不断下降。DHEA和许多与衰老相关的疾病有关。近年来研究发现DHEA在抗AS 方面也发挥重要作用。临床流行病学研究显示，动脉粥样硬化以及由此引发的心、 脑血管疾病与血
3、浆中低水平的DHEA有着密切的关系1 。DHEA在体内主要是在细 胞内细胞色素P450芳香酶的作用下降解成雌酮而发挥作用。由此可以推想，增加细 胞内细胞色素P450芳香酶的活性，应该可以特异性地加强DHEA在血管局部发挥抗 AS作用。研究表明，细胞色素P450芳香酶具有多个启动子，在内皮细胞及平滑肌细 胞中主要由启动子.6发挥作用， 维甲酸受体被激活后可通过.6启动子增强细胞色 素P450芳香酶的表达。因此，补充维甲酸受体激活物-全反式维甲酸应该可以增强 细胞内雌激素水平，从而特异性的增强DHEA的抗AS作用。本实验从体外、体内两 个水平进行研究。体外实验以ox-LDL作为刺激因素，体内实验以
4、高脂造成AS的动 物模型。 DHEA、 全反式维甲酸作为干预因素,VCAM-1作为检测指标,旨在探讨DHEA 抗AS的机制。 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 III 第一部分 脱氢表雄酮对高脂诱导的兔主动脉第一部分 脱氢表雄酮对高脂诱导的兔主动脉VCAM-1表达 的影响 表达 的影响 目 的 目 的 探讨脱氢表雄酮对高脂诱导的兔主动脉VCAM-1表达的影响，以及全反式维甲 酸在这一过程中的作用。 方 法 方 法 一、AS及治疗组模型的复制 40只正常成年雄性新西兰大耳白兔，体重2.0-2.5kg。随机分5组，每组8只，分 笼喂养。 （1）正常对照组：喂饲正常饲料。 （2）高脂模型组：喂饲
5、高脂饲料（含1 胆固醇、3猪油的饲料） 。(3)高脂DHEA组：喂饲加入DHEA(0.125g/kgd)的 高脂饲料。 （4）高脂DHEA全反式维甲酸组：喂饲加入DHEA(0.125g/kgd)和 全反式维甲酸 （0.6mg/kgd） 的高脂饲料。 (5)单DHEA组： 喂饲加入DHEA （0.125g/kg d)的正常饲料。各组白兔均喂养60天。实验周期结束后，各组大耳白兔用3%戊巴 比妥钠耳缘静脉麻醉（1.3ml/kg） 。固定后，迅速打开胸腔心脏采血，之后取心脏至 肾动脉分支的主动脉。从主动脉弓处取一小块血管，放入80冰箱，留做RT-PCR 之用。将剩下的血管放入4多聚甲醛中固定。 二、
6、血脂的生化检测 将所采血液用全自动生化分析仪检测血清中总胆固醇 （TC） 、 总甘油三脂 （TG） 、 高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C） 、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的含量。 三、斑块面积与总面积比、内膜中膜比的测定 将固定好的血管脱水、石蜡包埋、切片，做内弹力板染色。采用HMIAS-2000高 清晰度图像处理系统分析斑块面积与总面积比、内膜中膜比。 四、免疫组织化学 将固定好的血管脱水、石蜡包埋、切片，采用SP法，用兔抗兔VCAM-1多克隆 抗体和相应的免疫组织化学检测试剂盒进行免疫组织化学染色，一抗1：400稀释， 二抗1：1稀释，其余步骤按常规方法进行。用细胞胞浆内和胞膜上棕黄色阳
7、性颗粒 的平均吸光度值（A）表示其VCAM-1蛋白表达量。 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 IV 五、逆转录聚合酶链(RT-PCR)反应 用Trizol一步法提取各组主动脉的RNA， 将各组RNA逆转录成为cDNA。 取cDNA 产物进行PCR循环。最后所得反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色。继用 SQ9636 型扫描系统扫描, HMIAS-2000 型图像分析系统检测各组目的基因及内参的 积分吸光度值 (A) , 并以两者比值作为各组mRNA 的相对表达量。 六、统计学方法 所有实验数据使用SPSS 12.0软件处理，主要统计指标进行正态性检验，正态分 布的各个统计指标均
8、以均数标准差（xs）表示。多组间统计学差异显著性采用单 因素方差分析（ANOVA）,组间两两比较采用t检验。P0.05） 。 二、斑块面积与总面积比、内膜中膜比测定结果显示： 各组斑块面积与总面积比及内膜中膜比高脂组大于正常对照组（P0.05） 三、免疫组织化学结果显示： 阳性信号为细胞胞浆内和胞膜上棕黄色颗粒。与正常对照组相比高脂组的 VCAM-1蛋白表达明显增强(P0.05)。 四、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的结果显示： 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 V 各组主动脉均表达VCAM-1 mRNA，高脂组表达的mRNA明显高于正常对照组 （P0.05)。 结 论 结 论 DHE
9、A能够特异性的抑制高脂诱导的兔主动脉动脉粥样硬化斑块形成及 VCAM-1的表达。DHEA抑制VCAM-1的表达可能是其抗动脉粥样硬化的机制之一。 而全反式维甲酸对DHEA的这一作用并无明显增强。 关 键 词关 键 词 动脉粥样硬化；脱氢表雄酮；血管细胞黏附分子-1；兔主动脉 第二部分第二部分 脱氢表雄酮对脱氢表雄酮对ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞诱导的人脐静脉内皮细胞 VCAM-1表达的影响 表达的影响 目目 的的 探讨脱氢表雄酮对ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞VCAM-1表达的影响，以及 全反式维甲酸在这一过程中的作用。 方 法 方 法 一、人脐静脉内皮细胞的培养与分组 用胰酶消化法
10、获取人脐静脉内皮细胞（human umbilical venous endothelial cells,HUVEC） 。 培养于M199培养基， 内含15FBS,0.03谷氨酰胺,50g/ml ECGS。 待细胞长至融合状态，用0.1%胰酶消化传代。将生长良好的内皮细胞随机分为6组： 1 正常对照组：培养基中不加任何刺激因素； 2 ox-LDL组：培养基中加25mg/L ox-LDL； 3 ox-LDLDHEA(低浓度)组： 培养基中加25mg/L ox-LDL和100nmol/L DHEA； 4 ox-LDLDHEA(高浓度)组：培养基中加25mg/L ox-LDL和1000nmol/L D
11、HEA； 5 ox-LDLDHEA全反式维甲酸组：培养基中加25mg/L ox-LDL、1000nmol/L 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 VI DHEA和10-8mol/L全反式维甲酸； 6 DHEA组：培养基中加1000nmol/L DHEA； 以上各组均用相应药物作用24小时。 二、酶联免疫吸附法（ELISA） 将生长良好的HUVEC分组加药,作用24h,换常规培养基,12h后,收集各组培养基。 3000r/min,离心20min，收集各组上清。用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA)定量试剂盒测定HUVEC分泌至培养
12、基中VCAM-1蛋白 的含量。 操作严格按试剂盒说明书进行,实验结果在492nm波长读取吸光度值,并根据 标准曲线计算培养基中VCAM-1蛋白的含量。 三、 逆转录聚合酶链(RT-PCR)反应 用Trizol一步法提取各组HUVEC的RNA，将各组RNA逆转录成为cDNA。取 cDNA产物进行PCR循环。最后所得扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,GoldView染色, 继用SQ9636 型扫描系统扫描。 HMIAS-2000 型图像分析系统检测各组目的基因及内 参的积分吸光度值 (A),并以两者比值作为各组mRNA 的相对表达量。 四、统计学方法 所有实验数据使用SPSS 12.0软件处理，主要统计
13、指标进行正态性检验，正态分 布的各个统计指标均以均数标准差（xs）表示。多组间统计学差异显著性采用单 因素方差分析（ANOVA）,组间两两比较采用t检验。P0.05） 。 二、逆转录聚合酶链(RT-PCR)反应的结果： 各组细胞均表达VCAM-1 mRNA，ox-LDL组表达的mRNA明显高于正常对照组 （P0.05)。 结 论 结 论 DHEA能够特异性的抑制ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞VCAM-1的表达。这 可能是其抗动脉粥样硬化的机制之一。而全反式维甲酸对DHEA的这一作用并无明 显增强作用。 关 键 词关 键 词 动脉粥样硬化；脱氢表雄酮；人脐静脉内皮细胞；血管细胞黏附分子-1
14、华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 VIII Effects of Dehydroepiandrosterone on Expression of VCAM-1 in Rabbit Aorta and HUVEC Induced by High Level Lipid Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease, cytokines such as adhesion molecules and chemokines are involved in the pathologic process of atherosclerosis. Nu
15、merous risk factors including hyperlipidemia can induce arterial luminal endothelium dysfunction. This can increase the expression of cytokines such as vascular cell adhesion molecules-1(VCAM-1) on endothelium and VSMC. Thus promote the adherence of circulating monocytes to endothelium .Soon they also migrate into subendothelial space, then differentiate to macrophages there, subsequently convert to “foam cells“, which is the primary character of early atherosclerosis. From above mentioned, we know that adhesion molecules have important actions in atherosclerosis. Accordingly, i
