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1、农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology2006,14(6):957962 * 基金项目： 湖北省十五攻关计划重大项目 （No. Hu2001AA202A03） 和教育部新世纪优秀人才支持计划 （No. NCET- 04- 0732） 资助。 作者简介： 王劼(1980- )， 女， 博士研究生。E- mail: * 通讯作者. Author for correspondence. 教授， 博士， 主要研究方向： 动物营养调控和动物分子营养。 Tel： 027- 87286912； E- mail: . 收稿日期： 2006- 01- 07接受
2、日期： 2006- 03- 31 研究论文 重组 K88 黏附素亚单位蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 * 王劼,蒋思文,彭健 * (华中农业大学动物科技学院, 武汉 430070) 摘要： 采用响应面分析方法， 对肠毒素大肠杆菌 （Enterotoxigenic） K88 黏附素亚单位重组蛋白 FaeG 诱导表 达的主要影响因素进行了优化研究。响应面分析结果表明： 不同的诱导时机、 IPTG 浓度及诱导时间对目的蛋白表达量均有显 著影响 （ 30 为 标准， 通过模拟寻优得到最佳诱导条件为(编码值)： 0.8776 1原0.1224、 0.538521.0329和0.753831. 1034；在
3、此范 围 内获 得 最 佳 点 =（原0.5， 1.0， 1.0） =34.6； 即在 37 培养至 2.5 h 时， 加入 IPTG 至终 浓度 0.8 mmol/L，诱导 5 h，可使 FaeG 重组蛋白的相对表达量达到 最佳。根据拟合优化确定的最佳参 数做验证实验得出： 目的蛋白在全 菌蛋白中的表达含量为 35.4%， 与 模型预测值的相对误差为 2%。 根据单次单因子实验得到的 各因素最佳条件，即在 37 培养 至 3 h 时， 加入 IPTG 至终浓度 0.6 mmol/L，诱导 4 h 得到的 FaeG 重 组蛋白的相对表达量为 27.5%。 经过响应面优化后 FaeG 重组蛋白
4、图 2. 三因素两两交互作用对 FaeG 重组蛋白相对表达量影响的等高线图 Fig. 2. Contour map of the response surface funciton with absent variables at their middle level a.诱导时机与 IPTG 浓度的关系; b. IPTG 浓度与诱导时间的关系; c. 诱导时机与诱导时间的关系。 a.Induction starting time- IPTG concentration; b.IPTG concentration- inducing time; c. Induction starting ti
5、me- inducing time. 图 1. 诱导时机、 IPTG 浓度和诱导时间对 FaeG 重组蛋白相对表达量的影响 Fig.1. Effects of induction starting times, IPTG concentrations and inducing times on expression of recombinant FaeG 960 PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 第 5 期王劼等: 重组 K88 黏附素亚单位蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 的相对表达量为 35.4%；与前者相比提高了 28.7 % （图 3） ； 而与赵主江等 （2
6、005） 报道的 FaeG 重组蛋白 的相对表达量为 30%相比， 提高了 18.0%。 图 3. 响应面优化对 FaeG 重组蛋白表达量的影响 Fig. 3. Effect of RSA optimization on recombinant FaeG expression M, marker; 13, 优化前 FaeG 的表达; 46, 优化后 FaeG 的表达。 M, marker; 13, no optimized condition; 46, optimized condition. 3讨论 3.1 IPTG 诱导时机、浓度和诱导时间对目的蛋白 表达量的影响 降维分析结果显示，目的蛋
7、白的相对表达量随 诱导前培养时间的延长而逐渐增加；但当诱导物添 加前的培养时间超 2.5 h 后，目的蛋白含量增长趋 缓， 甚至有下降的趋势。 这与杨静等(2002） 采用单次 单因子研究时间对旋毛虫 Ts87 抗原基因在 BL21 中表达影响时发现的规律较为一致。这可能是因为 时间较短， 收获细菌时细菌密度比较小， 因而蛋白的 表达量偏低 （陆海等， 2001） ； 时间太长， 大部分细菌 的生长超出对数生长期而逐渐死亡，因此有的细菌 不表达或表达量降低从而导致总蛋白量减少 (沈立 新等， 2000； 章文贤等， 2003)。 陈卫等 （2002） 在对半乳糖苷酶基因在大肠杆菌 中过量表达及
8、 IPTG 诱导条件进行单因素研究时发 现， IPTG 在浓度大于 0.8 mmol/L 后， IPTG 对其表 达没有显著的影响。与本实验降维分析显示的规律 较为一致。诱导物浓度过高有可能减少目的蛋白的 表达量 （刘向辉等， 2002） ， 这与过高的 IPTG 浓度对 大肠杆菌的生长的抑制有关。此外， 由于 IPTG 是一 种比较贵重的化合物， 就经济方面考虑， 用量适中， 达到最佳诱导目的即可。 本实验降维分析还发现， 随着诱导时间的延长， 目的蛋白的表达量也随之增加；当诱导时间超过一 定的长度时， 目的蛋白表达量有降低的趋势； 这与其 他研究者研究诱导时间对重组蛋白在大肠杆菌 BL21
9、 （DE3） 中表达的影响时的结果一致 （陈卫等， 2002； 刘向辉等， 2002） 。 诱导时间过短表达产物未能 充分形成， 诱导时间过长表达量下降。 推测一是和营 养的耗乏有关，二是宿主菌中可能存在一些蛋白分 解酶， 延长诱导时间， 新生成的重组蛋白受到酶解， 来不及形成包涵体或表达产物的降解率远大于合成 的速率 （隋广超和胡美浩， 1994） 。 然而， 在实际的诱导表达过程中， 不能把每个因 素看成是相对独立的事件， 而是一个有机整体。 各种 因素之间是协同作用， 相互影响的。 本实验结果亦证 实诱导时机、 IPTG 浓度和诱导时间三者之间的确存 在着显著的互作作用，而且该作用对目的
10、蛋白的影 响非常复杂。 因此， 要获得目的蛋白高效表达的最佳 条件， 须要考虑各种因素之间的交互作用， 通过合理 的实验来确定。 3.2 响应面分析法优化目的蛋白的诱导表达条件 过去的研究者常常采用单次单因子法研究重组 蛋白诱导表达条件。这种方法是在假设因素间不存 在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水 平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考 察的优化方法。但是由于考察的因素间常常存在交 互作用， 使得该方法并非总能获得最佳优化条件。 另 外， 当考察的因素较多时， 需要太多的实验次数和较 长的试验周期。正交设计法可以反映多因素间的内 在规律， 并找到最优水平组合， 但此方法仅能比
11、较各 因素已选定水平的优劣，而无法提供未考察区域的 信息和各因素之间的交互协同作用。响应面分析法 弥补了以上的不足。响应面分析法是用一个多元回 归方程 （回归函数） 拟合多个因子与实验结果 （响应 值） 之间的关系， 即利用回归方程作函数估算工具， 计算确定回归方程的系数，并通过对该方程求极值 的方法达到参数优化的目的 （Box 和 Draper， 1987） 。 根据响应面分析数据作出参数与响应值之间的等高 线图， 可以直观全面的反映参数对响应值的影响， 以 及参数之间的关系。 因此， 响应面分析法是基于面上 的分析， 与基于点上分析的正交设计法相比， 它提供 了更多的信息。本实验结果便印证
12、了响应面分析法 不仅可以逐一反映单因素对响应值的影响规律， 还 可以较好的反映出因素间的互作作用及其对响应值 的影响。 与单因素试验得到的最佳诱导条件相比，通过 响应面分析法的模拟优化，获得的最佳诱导表达条 件下， 目的蛋白 FaeG 在大肠杆菌 BL21 （DE3） 中获 得了更高效的表达。 由此说明， 寻找各因素对目的蛋 白表达的最佳作用参数，不能忽略各因素之间的交 互作用对目的蛋白表达的影响；而响应面分析法比 961 PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 农 业 生 物 技 术 学 报2006 年 参 考 文 献 Box G E P and Draper N
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