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1、兔Vx2肝癌改良模型的建立及其DSA影像分析 作者：曹玮，王执民，张洪新，王义清，郭卫平，李文献，倪代会，梁志会，齐连君 【关键词】 兔 关键词: 兔;肝脏Vx2肿瘤;数字减影成像 摘 要:目的 建立可供实验研究的稳定的兔Vx2移植性肝癌模型，探讨不同植瘤方式的成功率，并分析该肿瘤的DSA影像特征. 方法 新西兰白兔60只，随机分3组，每组20只.将Vx2瘤细胞（5107 个）经肝动脉或经肝包膜分别接种于2组兔的肝左叶，建立对照肝癌模型.第3组经肝包膜植入瘤组织块（约含106 108 个瘤细胞）建立改良肝癌模型.观察:不同组植瘤的成活率;改良组肿瘤7，10，14，17和21d时的体积（B超测）
2、，并计算肿瘤生长率;大体及镜下（光镜和电镜）瘤组织形态特征;改良Vx2移植性肝癌的DSA影像特征. 结果 3组植瘤成活率分别为7/20，10/20和19/20，改良组植瘤成活率最高（P<0.05），瘤体呈指数性生长，组织病理及电镜表明该瘤在肝组织中浸润式生长，其形状与移植于兔其他部位的Vx2鳞状细胞癌特征相似.DSA影像示该移植性肝癌具有丰富的血供. 结论 成功建立了兔Vx2移植性肝癌改良模型，瘤组织块种植方式成功率明显高于动脉途径和细胞液注射方式，为肝癌研究提供了大型实验模型. Keywords:rabbit;liver Vx2neoplasms;digital substract a
3、n-giography Abstract:AIM To establish suitable metastatic rabbit Vx2 liver tumor model for experimental study，probe into differ-ent tumor transplanted methods and analyze the DSA（digital substract angiography）imagining features of the liver tumor.METHODS 60male New Zealand white rabbits were divid-e
4、d into3groups at random，20in each group.5107 Vx2carcinoma cells were injected via hepatic artery，pecutaneous into liver by syringe needle in the different2groups（control groups）;the3rd group（retrofit group）were transplanted tumor tissue mass（about106 10 8 carcinoma cells）into liv-er.Then we observed
5、:the success rate of implanting tu-mor;the volume change of tumor by ultrasonograpy（the growth rate of tumor was calculated）;the biological fea-tures of tumor（histopathology and electronic microscope photographs）;the DSA imagining features of tumor.RESULTS The success rates of transplanting tumor of
6、3groups were7/20，10/20，19/20;the retrofit group was the highest of3groups（P<0.05）.The tumor grew as exponen-tial curve.Histopathology and electronic microscope pho-tographs indicated that tumor grew in the liver tissue and in-filtrated into the normal liver tissue，and that it had the simi-lar bio
7、logical features of squamous cell carcinoma transplant-ed in other sites of rabbits.The DSA imagining of tumor in-dicated that the carcinoma had liberal blood vessels.CONCLUSION A retrofit metastatic rabbit Vx2liver carci-noma model has successfully been set up，The success rate of the method by whic
8、h tumor tissue mass transplanted is obvi-ously higher than the other two methods.This makes it pos-sible to gain a reliable mature large tumor animal model for study. 0 引言 原发性肝癌的介入性治疗已成为当前综合治疗肝癌的有效手段之一，经导管栓塞化疗可有效地抑制癌瘤生长、延长生存期、改善生存质量，目前已成为中晚期肝癌的首选治疗方案，与近年来发展起来的高温、冷冻、乙醇注射等新疗法一样，其技术仍需改进，为进一步提高疗效仍需深入研究.
9、故有效的评价新的介入技术及其治疗效果的动物模型就显得犹为重要.目前能够复制的肝癌模型如裸鼠，因其个体体积较小，不能模拟在体肝癌的介入治疗情况，故建立可供介入性实验观察的肝癌动物模型是需解决的问题之一.本研究根据国外文献进行复制，并在此基础上进行改进，建立了兔Vx2肝癌改良模型，有效地解决了介入性基础实验研究的关键环节，为提高临床介入治疗肝癌的效果，提供了可靠的基础实验数据. 1 材料和方法 1.1 材料 新西兰白兔60只，体质量2.52.7kg，雌雄各半，由本校动物实验中心提供.兔Vx2癌株由日本京都Funabashi Farm公司提供，癌株种类为Vx2鳞状细胞癌.1250mA，Polydor
10、os-100附带DSA的大功率X线机（德国Siemens公司生产），2/3FMag微导管（Cook公司，顶端自塑形为“C”）. 1.2 方法 取冰冻Vx2瘤细胞悬液，按一般细胞培养技术1 进行复苏后离心5min（800r min -1 ）.除去上清液，加入PBS液用玻璃棒搅匀，取悬液置于RP-MI1640培养液中，按文献2细胞培养传代，台盼蓝染色，死、活细胞计数，将培养液调制成1010 个 L-1 活细胞密度.将新西兰兔随机分为3组，每组20只.第1组:瘤细胞悬液（51010 个 L-1 ）经动脉注入1.0mL.第2组:瘤细胞悬液（51010 个 L-1 ）经肝包膜注入1.0mL.第3组（改良
11、法）:生理盐水与瘤块的混悬液约1.0mL经肝包膜注入.瘤块取自兔后腿外侧肌肉接种瘤株2wk后的实质性包块，切取包块边缘生长旺盛的鱼肉样组织，用眼科剪剪碎，与生理盐水混悬瘤细胞约109 10 11 个 L-1 .兔经戊巴比妥钠（30mg kg-1 ）iv麻醉后，取上腹部正中切开腹腔，将兔肝左中央叶充分暴露.挑开肝包膜，将悬液用16号针头注入肝实质内接种;将兔麻醉后，置于仰卧位固定，右侧腹股沟备皮消毒后，经股动脉搏动处沿其纵轴切开皮肤.钝性分离暴露右侧股动脉，暂时夹闭近端，用4号丝线提起远端股动脉，用眼科剪剪开一小斜口，将导管鞘插入固定，随后导入2/3F微导管，在X线机透视下，间断注入600g L
12、-1 复方泛影葡胺以显示导管顶端位置，插管至胃肝动脉接种及行DSA（数字减影）3-6 .观察指标:观察不同接种途径的成功率;利用B超监测肿瘤在7，10，14，17和21d时的体积变化（V=0.5ab2 ，a和b分别是最大和最小直径），并计算肿瘤生长率（tumor growth rate，TGR）;瘤组织大体及镜下形态学观察;兔Vx2移植性肝癌的DSA影像特征. 统计学处理:Students t test，Mann-Whitney U test，P<0.05有统计学意义. 2 结果 2.1 接种成功率 肝实质瘤块移植组成功率（19/20）最高，与经胃肝动脉注射组植瘤成功率（7/20）比较差
13、别显著（P<0.01），与肝实质直接注射瘤细胞组成功率（10/20）比较差别显著（P<0.05）. 2.2 肿瘤生长参数 接种17d的肿瘤体积、直径较前增长迅速，TGR为93.9%，与前比较差别有显著性（P<0.05），接种21d的肿瘤体积、直径较前增长缓慢，TGR为60.6%，与前比较差别无显著性（P>0.05，Tab1）.肿瘤体积、直径呈指数性生长，在接种17d后生长迅速，肿瘤体积增长快于直径增长（Fig1）.表1 不同接种时间的肿瘤体积、肿瘤直径及生长率（略） 2.3 肿瘤形态学 处死荷瘤兔，剖腹见肿瘤在肝实质内呈圆形，结节状，无包膜.肿瘤结节呈灰白色，鱼肉样，质
14、硬，其内可见丰富的供瘤血管（Fig2（略）.低倍镜下（Fig3A（略）可见肝内浸润性癌巢，与肝实质无明显边界，间质分界不清，结缔组织较少，癌巢边缘分布着被浸润的肝索结构.肿瘤细胞弥散排列，可见纤维间隔，新生毛细血管丰富.高倍镜下（Fig3B（略）见瘤细胞体积大，形态不规则，呈不规则排列.胞质丰富，淡红染色.核肥大，其大小及形态各异，染色浓淡不均，核分裂像多见. 电镜（Fig4（略）:可见瘤细胞呈多形性，大小不等，常见分裂相.细胞间连接较松散，偶见桥粒.细胞表面有许多短小微绒毛伸入到相邻的细胞间隙.核大畸形，核膜清楚，常染色质丰富，染色颗粒较粗，核仁明显，可见多个核仁.胞质内有丰富的游离核蛋白体
15、，散在的线粒体，高尔基复合体及分泌颗粒，并可见成束的张力原纤维，提示为中分化鳞癌. 2.4 肿瘤DSA影像特征 经微导管注入适量造影剂后，胃肝动脉显影良好，胃的轮廓及胃底动脉清晰显示（Fig5）.肝的轮廓显示良好，肝实质造影剂浓密，肝内动脉分支显影欠清晰.箭头所示为两个瘤染色区，造影剂浅淡，其周围可见粗大的供瘤动脉，染色浓，走行分支清晰，被瘤体推压成“抱球状”，瘤区内部可见网片状瘤染色. 3 讨论 3.1 Vx2瘤生长特性 本实验结果显示，瘤株于肝脏成活后呈指数性生长，23wk生长最旺盛，其体积迅速增大，切面呈实质性，中心无变性坏死.此阶段为供瘤血管形成期7，8 ，毛细血管大量形成，供养丰富.4wk后肿瘤中心出现变性坏死灶，并有肺和腹腔淋巴结转移，此阶段为供瘤血管稳定期7，8 ，瘤体增长快于血管增生，瘤中心因缺血而坏死.67wk肿瘤中心呈大片液化坏死灶并形成囊腔.此阶段为供瘤血管退化期7，8 ，血管增生相对减缓，瘤体大部坏死.故进行肿瘤传代、模型制作及进行实验研究时，不宜太晚，一般以4wk为宜，以免因肿瘤坏死和转移影响实验结果. 3.2 Vx2瘤移植途径 目前Vx2瘤株在体成瘤率仍很低，如何提高植瘤成功率，是本实验的重点.我们回顾了国外的文献，对不同移植途径做一比较，证实瘤块移植成瘤率高.瘤细胞在体种植如同种子与土壤，其成活依赖两个条件:浓度.环境.瘤细胞浓
