《rhKGF2滴眼液对角膜损伤的药效学研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《rhKGF2滴眼液对角膜损伤的药效学研究（65页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、重庆医科大学 硕士学位论文 重组人角质细胞生长因子异构体（rhKGF-2）滴眼液对角膜损伤 的药效学研究 姓名：李薇 申请学位级别：硕士 专业：药理学 指导教师：周远大 20080501 重庆医科大学硕士研究生学位论文 符号说明 英文缩写英文全称 中文全称 Aa b s o r b a l i c e 吸光度 b F G Fb a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r 碱性成纤维细胞生长因 子 C N Vc o m e a ln e o v a s c u l a r i z a t i o n 角膜新生血管 C T G FC o n n
2、 e c t i v e t i s s u eg r o w t hf a c t o r结缔组织生长因子 d d a y 天 D M E MD u l b e c c o Sm o d i f i e dE a g l e Sm e d i u m D u l b e c c o 改良的E a g l e 培 养基 D M S O D i m e t h y ls u l f o x i d e 二甲基亚砜 D X MD e x a m e t h a s o n e 地塞米松 E D T A E t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i
3、 ca c i d 乙二胺四乙酸 F B SF e t a lb o v i n es e r u m胎牛血清 hh o u r小时 H a z eH a z e 角膜上皮下雾状混浊 H E H e m a t o x y l i na n dE o s i n 苏木精一伊红染色 K G F k e r a t i n o c y t eg r o w t hf a c t o r 角质细胞生长因子 M T T M e t h y lt h i a z o l y lt e t r a z o l i u m 四甲基偶氮唑盐 m i n m i n u t e s 分 N S n o r m
4、a ls a l i n e 生理盐水 P B S P h o s p h a t e b u f f e r e ds o l u t i o n 磷酸盐缓冲溶液 P C R p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n 聚合酶链反应 r h K G F 2r e c o m b i n e dh u m a nk e r a t i n o c y t e 人重组角质细胞 g r o w t hf a c t o rv a r i a n t 2 生长因子一2 R T - P C RR e v e r s et r a n c r i p t i
5、o np o l y m e r a s ec h a i n 逆转录聚合式酶链反应 r e a c t i o n l 重庆医科大学硕士研究生学位论文 S A B C S t r e p ta v i d i n b i o t i n e n z y m eC o m p l e x 链霉素亲和素一生物素一 T E m s H C la n dE D T Ab u f f e rT f i s T G F B l t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o v B l w kw e e k 2 过氧化物酶复合物 盐酸乙二胺四乙酸缓冲 液 转化生长
6、因子一p l 星期 重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任 学位论文作者签名：丝日期：立堑咝：竺：厶 学位论文版权使用授权书 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学 位期间论文工作的知识产权单位属重庆
7、医科大学。本人保证毕业离校后，发表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，学校可以公布学 位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，可以采用影印、缩印或其他手段保 存论文 论文作者签名： 指导教师签名： 日 期： 重庆医科大学硕士研究生学位论文 重组人角质细胞生长因子异构体( r h K G F 一2 ) 滴眼液对 角膜损伤的药效学研究 摘要 研究背景 眼睛的视光学特征，主要依赖于角膜的透明组织结构。由于机械 伤、手术、化学烧伤及其他原因引起的角膜外伤是一种常见的眼表疾 病，损伤深达角膜的各个层面，极易
8、感染引发溃疡。而当损伤深达角 膜基质层，修复时，活跃的角膜成纤维细胞过度增殖，生成大量胶原 填充缺损，新的胶原纤维排列不规则，在临床上留下不同程度的瘢痕， 严重影响视力。 角质细胞生长因子( k e r a t i n o c y t eg r o w t hf a c t o r ，K G F ) 属于成纤维 细胞生长因子( F G F ) 家族中的第七个成员，能够介导多种组织表( 上) 皮细胞增殖和分化。随着研究深入，E m o t o 等从人肺中克隆到一种新 的生长因子( k e r a t i n o c y t eg r o w t hf a c t o r - 2 ，K G F 2
9、 ) ，它的特异性受体 为酪氨酸激酶受体F G F R 2 I I I b ( K G F R ) 禾I F G F R 。K G F 2 能促进角质上 皮细胞的增殖，刺激损伤组织周围上皮细胞的再生、分化和迁移，而 对成纤维细胞和内皮细胞则无直接作用，可以减轻伤口愈合反应1 射。 K G F 2 已经得到肯定的的治疗作用包括：加速皮肤切口的损伤修复； 治疗溃疡；激活角膜上皮干细胞，使其不断增值分化，从而促进 3 重庆医科大学硕士研究生学位论文 角膜上皮损伤的愈合1 3 1 。本课题组前期通过对K G F 2 的氨基酸序列突 变，研制出新的变构体：人重组角质细胞生长因子2 ( r e c o m
10、 b i n e d h u m a nk e r a t i n o c y t eg r o w t hf a c t o rv a r i a n t 2 ，r h K G F 一2 ) ( 专利号： 0 31 0 11 5 6 ) ，保留其促进上皮生长的作用，改变其促进成纤维细胞生长 作用为抑制，用于治疗肝纤维化，取得较好结果【4 5 1 。 目的 本研究通过在体实验和离体实验，研究r h K G F 2 滴眼液在、离体 实验中对兔角膜损伤的治疗作用，并观察r h K G F 2 对兔角膜成纤维及 上皮细胞的生长、增殖的影响，初步探讨其作用机制。 方法 1 6 0 只家兔，均以lm o
11、 lr n l 1 的氢氧化钠溶液建立碱烧伤模型， 选左眼为实验眼，随机分成5 组。其中3 组为治疗组，分为3 种浓度 ( 0 0 5 、0 0 2 5 、0 0 1 2 5 ) r h K G F 一2 滴眼液；阳性对照组：贝复舒( b F G F ) 滴眼液；溶媒对照组：r h K G F 一2 滴眼液的溶媒。裂隙灯下观察各组角膜 上皮愈合速度( 率) 及C N V 发生，光镜观察角膜组织学形态变化。 2 5 4 只家兔，均在显微镜下行双眼板层切割损伤模型，随机分 为6 组，其中3 组为治疗组，分3 种浓度( O 0 5 、0 0 2 5 、0 0 1 2 5 ) r h K G F 2
12、滴眼液；另3 组分别为：b F G F 对照组：b F G F ( 2 4 0 0A U m l 一) 滴眼液；地塞米松对照组：地塞米松( 磷酸钠) 滴眼液( O 2 5m g m l 。) ； 溶媒对照组：r K G F 2 滴眼液的溶媒。镜下观察各组兔术后角膜上皮愈 合速度( 率) ，通过裂隙灯观察角膜上皮下雾状浑浊( H a z e ) 差别，电 镜及光镜观察角膜组织学形态、超微结构变化。 4 重庆医科大学硕士研究生学位论文 3 原代培养兔角膜成纤维及上皮细胞，通过M T T 、R T - P C R 等技 术，检测r h K G F 2 对兔角膜成纤维及上皮细胞生长情况的影响，并初 步
13、探讨其作用机制。 结果 1 建立兔角膜碱烧伤模型，模型成功率1 0 0 ，并诱导C N V 。在碱 烧伤后2 4h 内，各浓度r h K G F 2 滴眼液均能显著促进上皮愈合，与溶 媒对照组相比，有显著差异( P 0 0 5 ) 。 。1 2 0 矗 k 舌1 0 0 叠 曼0 8 0 每 专0 6 0 厶 o 0 4 0 曩 兰0 2 0 o U 0 0 0 0 0 5 0 0 2 5 0 0 1 2 5 b F G F r h K G F - 2r h K G F - 2r h K G F 2 g r o u p D X MV e h i c l e c o n t r o l 图2 -
14、 1兔角板层切割术后2 4 h 内上皮生长速率( m m 2 h ，n = 1 2 ) F i g2 - 1 T h ec o r n e a lr e e p i t h l i a l i z a t i o nr a t eo fd i f f e r e n tg r o u p sa f t e rm e c h a n i c a li n j u yo n r a b b i t ( m m 2 h 一，n = 1 2 ) 3 3 角膜H a z e 的观察评分 由图2 2 所示术后各时间点，r h K G F - 2 药物各治疗组H a z e 评分较空白组轻， 其评分与空白组
15、比较有显著性差异( P O 0 5 ) ，且无上皮再脱落现象 发生。由此可知，r h K G F 2 在角膜板层切割模型中确有一定的抑制上皮愈合作用， 但其再覆盖速率并未有明显减慢。通过病理检查可见r h K G F 2 各剂量组的上皮细 胞的形态恢复较好，细胞层数正常，一个月时已能形成完整均匀的基底膜，而空 白组上皮细胞体积增大、细胞层数增多，细胞排列混乱。 r h K G F 一2 滴眼液在碱烧伤和角膜板层切割模型中，对于角膜上皮的愈合有两 种截然不同的影响，这与角膜在受到化学刺激和机械性损伤后其自身的创伤后愈 合反应不同密切相关，但其详细的机制不明确。 二、r h K G F 2 滴眼液
16、对角膜损伤后基质层修复的影响 基质层基质层占角膜厚度的9 0 ，主要由胶原纤维、粘合物质和成纤维细胞 组成。基质的胶原纤维很规则、均匀，胶原纤维束构成片状，层层紧密相叠，基 质层的层状结构使角膜在剥离术中可以相当容易地分离。角膜损伤后，如果伤口 深达角膜基质，在损伤修复时期，活跃的成纤维细胞过度增殖，生成大量胶原填 充缺损，新的胶原纤维排列很不规则，在临床上也会留下不同程度的瘢痕，严重 影响视力。现在临床上仍缺乏安全有效的预防和治疗药物。我们选择角膜碱烧伤 和角膜板层切割这两种临床上常见的损伤方式作为实验模型，研究r h K G F 2 滴眼 液对于角膜损伤后基质层修复的影响。 在碱烧伤模型中，角膜碱烧伤3 天后多伴有有角膜新生血管的出现，在临床 上如不及时治疗，将会形成一层厚实的有大量新生血管存在的角膜白斑，极大破 坏角膜的免疫赦免状态，这对视力的恢复以及之后的光学性角膜移植带来极大困 难。实验发现碱烧伤
