膨润土对悬浮培养肉苁蓉细胞生物合成苯乙醇苷的影响

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1、膨润土对悬浮培养肉苁蓉细胞生物合成苯乙醇苷的影响膨润土对悬浮培养肉苁蓉细胞生物合成苯乙醇苷的影响* 李 娟 李 春* * 沈慧慧 易丽娟 刘慧英 （石河子大学化学化工学院，新疆石河子 832003） 摘 要 摘 要 通过测定细胞生物量、苯乙醇苷含量、细胞内多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的酶活性以及培养基 中钙离子浓度的变化，发现添加含有丰富钠、钙离子的膨润土能够促进悬浮培养肉苁蓉（Cistanche deserticola）细胞合成苯乙醇苷类化合物。将初始浓度为 2g/L 的钙基膨润土添加到肉苁蓉细胞的培养基中， 细胞生物量干重达 21.79g/L 及苯乙醇苷含量达干重的 23.18%，分别是不添

2、加膨润土实验的 122.40%和 122.65%，钙基膨润土处理的细胞最高产量可以达到 5009.19mg/L。研究发现钙基膨润土缓慢释放钙离子， 能够促进细胞对钙离子的吸收，从而有利于细胞生长和苯乙醇苷类化合物的合成。 关键词 关键词 植物细胞培养 膨润土 肉苁蓉 苯乙醇苷类化合物 PROMOTION OF CELL GROWTH AND PRODUCTION OF PHENYLETHANOID GLYCOSIDES IN CISTANCHE DESERTICOLA CELL SUSPENSION CULTURES BY BENTONITES LI Juan, LI Chun *, SHEN

3、 Huihui, YI lijuan and LIU Huiying (School of Chemistry and Chemical Engineering, Shihezi University, Xinjiang Shihezi 832003,China) Abstract The changes of suspention culture of Cistanche deserticola induce by bentonites including biomass of cell , the contents of phenylethanoid glycosides(PeGs), a

4、ctivities of polyphenol oxidase（PPO） and phenylalanin ammonia-lyase（PAL）in cell and the concentration of Ca2+ in medium were investigated. The growth of cell and the concentration of PeGs improved markedly as a result of inducing by bentonites. When the initial concentration of bentonites was 2g/L,

5、the dry weight of cell was 21.7875g/L and the percentage of PeGs was 23.18%. The dry weight and the content of PeGs induced by bentonites were 122.4% and 122.65% than those in cell without bentonites, respectively. Ca2+ was released from bentonites slowly, and it can promote the growth of cell and b

6、iotransformation of PeGs. Key words plant cell culture, controlling of nitration, Cistanche deserticola, phenylethanoid glycosides 引 言 引 言 肉苁蓉（Cistanche deserticola）又名大芸、寸芸、苁蓉等，属列当科（Ocobanchaccae） 寄生植物， 国家二级保护植物。 其干燥带鳞片的肉质茎有补肾阳、 益精血、 润脾滑肠之功效， 在抗衰老类方剂中仅次于人参。主产于内蒙古、新疆、甘肃、宁夏、青海等省区的荒漠中， 素有“沙漠人参”之美誉1。肉苁蓉

7、含有苯乙醇苷类化合物、生物碱和多糖类，以及多种维生 素与微量元素等生物活性物质， 具有多种药用功效与保健作用。 但野生肉苁蓉资源遭到严重 破坏， 为了保护野生肉苁蓉资源， 利用植物细胞培养技术生产肉苁蓉的有效成分是一种有效 方法2，3。采用植物细胞培养技术进行肉苁蓉细胞的大规模培养生产苯乙醇苷类化合物， 既可以满足临床上对肉苁蓉药物的需求，又可以保护自然资源，维护生态环境。而随着人们 对植物体系中钠、钙等离子分布及作用的不断认识，信号传导的研究已成为热点领域。膨润 土其主要成分蒙脱石具有两层硅氧四面体夹一层铝氧八面体所组成的 21 型晶体结构，层 间吸附 Ca2+、Na+等阳离子4。膨润土作为

8、良好的纳米吸附材料被广泛用于葡萄酒、果酱及 食用油脂的脱色中。一方面膨润土中含有丰富的钠、钙离子，而且它的层间结构能够起到金 属离子的缓释作用， 另一方面膨润土对色素、 酚类等对细胞生长有害的物质具有良好的吸附 功能，所以本文以肉苁蓉细胞为实验材料，研究钠基、钙基膨润土对摇瓶液体培养的肉苁蓉 细胞生长及苯乙醇苷类化合物合成的影响。 1 材料与方法 1 材料与方法 1.1 实验材料实验材料 肉苁蓉Cistanche deserticola采于新疆古尔班通古特沙漠南缘，其茎芽为外植体诱导 愈伤组织，并经本实验室筛选、继代培养保存 15 代以上。不同膨润土由新疆夏子街膨润土 公司生产。 1.2 培养

9、方法及条件培养方法及条件 150ml 三角瓶中装 40 ml 改良的 B5 培养基(附加 2.0 mg/L KT，0.5 mg/L IAA，30g/L 蔗糖)，pH 5.86.0。鲜重接种量保持在 10%左右（w/v） 。培养条件：温度(25+1)，黑暗培 养 30 天，摇床转速 110 r/min。细胞生长到对数生长期的末期第 18 天时添加膨润土，第 19 天进行胞内外指标的测定。 1.3实验方法实验方法 1.3.1 细胞生长量的测定 摇瓶培养取样细胞于 5000r/min，4离心 30min，吸出上清液用于电导率、pH 等胞外 指标的测定；湿细胞经滤纸吸干后称量得细胞鲜重；然后置于-50

10、真空冷冻干燥得细胞干 重。 1.3.2 细胞苯乙醇苷含量的分析 苯乙醇苷含量测定参照文献3， 收获细胞经-50冷冻干燥， 充分研磨后加入适量甲醇， 60下甲醇超声浸提，采用 Cintra 20 Double Wavelength/ Double Beam Spect rophotometer (Hitachi Co. Ltd.Tokyo, Japan) 在 334.5nm 处，以松果菊苷为标准品，测定苯乙醇苷含量。 标准曲线为：C=62.1118A+0.1553（r2=0.9997） ，其中 C 为苯乙醇苷浓度，单位g/mL，A 为 吸光度。 1.3.3 电导率测定采用上海精密仪器公司雷磁电导

11、率仪。 1.3.4 pH 测定采用北京赛多利斯仪器设备公司 PB-20 标准型 pH 仪5,6。 1.3.5 钙离子的浓度测定采用日立 Z-8000 型原子吸收光谱法测定。 2 结果与讨论 2 结果与讨论 2.1 膨润土对肉苁蓉细胞生长及苯乙醇苷类化合物合成的影响膨润土对肉苁蓉细胞生长及苯乙醇苷类化合物合成的影响 细胞生长到第 18 天，即对数生长期的末期，在培养基中添加钠基和钙基膨润土对细胞 生长及苯乙醇苷类化合物合成的影响见图 1。CK 为对照，钠基膨润土实验组为 control 1， 钙基膨润土实验组为 control 2。 051015202530 4 6 8 10 12 14 16

12、18 20 22 24 dry weight(g/L) Time (d) CK control 1 control 2 051015202530 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 concentrations of PeGs(%) Time(d) CK control 1 control 2 图1 添加膨润土对细胞生长的影响 Fig. 1 Effects of bentonites on cell growth 图2 添加膨润土对苯乙醇苷类化合物合成的影响 Fig. 2 Effects of bentonites on percentage of PeGs 05101

13、5202530 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 Production of PeGs(mg/L) Time (d) CK control 1 control 2 图 3 添加膨润土对苯乙醇苷类产量的影响 Fig. 3 Effects of bentonites on production of PeGs 由图 1 和图 2 可以看出钙基和钠基膨润土对肉苁蓉细胞生长和苯乙醇苷类的合成都有 促进作用。钠基膨润土处理的肉苁蓉细胞最大干重达 20.18g/L，苯乙醇苷最高含量达干重的 22.20%； 钙基膨润土处理的细胞最大干重可达21.79g/L， 苯乙醇苷最高含量达

14、干重的23.20%， 分别是不添加膨润土实验的 122.40%和 122.65%。从图 3 可以看出，钙基膨润土处理的细胞 最高产量可以达到 5009.19mg/L。 从图 1 和图 2 可以看出肉苁蓉细胞生长与主要成分苯乙醇苷的合成属于生长耦连型， 即 肉苁蓉细胞在生长的同时积累苯乙醇苷， 不同于一般植物细胞的生长与次生产物的合成的关 系，细胞生长分裂越旺盛，单位细胞的次生代谢产物含量越低7。从图 1 和图 2 也可以看 出，在培养基中添加膨润土后，引起肉苁蓉细胞生长速度加快，积累合成次生代谢产物苯乙 醇苷的速度加快，而且积累量大大提高。 2.2 膨润土对肉苁蓉次生代谢关键酶的影响 2.2

15、膨润土对肉苁蓉次生代谢关键酶的影响 在培养基中添加膨润土后，细胞内多酚氧化酶（PPO）活力和苯丙氨酸解氨酶（PAL） 变化见图4，5。加入钙基和钠基膨润土的第一天，肉苁蓉多酚氧化酶酶活力有不同的表现， 钙基膨润土对PPO的酶活有很大提高，而钠基膨润土对PPO活性的影响也不大。从图5可以 看出，在加入两种膨润土的第1天，肉苁蓉细胞受到刺激后PAL的酶活都有所降低，细胞适 应之后，两种膨润土对肉苁蓉PAL的酶活都有较大提高。 051015202530 0 60 120 180 240 Time (d) CK control 1 control 2 051015202530 100 120 140

16、160 180 200 220 240 260 Time (d) CK control 1 control 2 图4 添加膨润土对细胞外酚含量的影响 Fig.4 The effects of bentonites on phenol in medium 图5 添加膨润土对肉苁蓉细胞PAL酶活的影响 Fig.5 The effects of bentonite on PAL in cell 在培养基中添加钠基和钙基膨润土均能引起肉苁蓉细胞的快速生长和次生代谢产物苯 乙醇苷的快速积累。PPO和PAL是肉苁蓉细胞合成苯乙醇苷途径中的两个关键酶，钙基膨润 土对这两种关键酶的酶活均有较大提高，钠基膨润土只对PAL酶的酶活有较大提高，说明两 种膨润土对肉苁蓉细胞生长和苯乙醇苷合成的诱导方式不同， 这可能是钙基膨润土比钠基膨 润土诱导结果显著的原因。 2.3 膨润土对肉苁蓉悬浮体系中电导率与pH的影响 2.3 膨润土对肉苁蓉悬浮体系中电导率与pH的影响 培养液中的 pH 值和电导率作为细胞悬浮培养的重要因素对细胞生长起重要作用， 是因 为培养基