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1、独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。一躲覆导师躲问痧明时间：硐时间：内|年f月私年石月细关于论文知识产权和使用授权的说明本论文的知识产权为沈阳农业大学所有。本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇
2、编学位论文。同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的内容。学位论文中的所有内容不经沈阳农业大学授权不得以任何方式擅自对外发表。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名导师签名：c司争参姻时间。7伊7年f，目f昨日帆口07年月归沈阳农业大学硕士学位论文摘要梅花鹿血是一种传统名贵中药。本论文首先分析了梅花鹿血中的主要化学成分；其次，对酶解梅花鹿血制备抗氧化活性多肽的条件进行了优化研究，并对抗氧化活性多肽进行分离纯化和定性分析；最后，对抗氧化活性多肽的抗衰老功能进行了动物试验研究。梅花鹿血的化学成分分析表明，梅花鹿血中水分含量为8109；灰分含量为317；脂肪含量为05
3、9；蛋白含量为1499；棕榈酸含量为165meg，硬脂酸含量为035mgg，油酸含量为O69mgg，亚油酸含量为O98meg，亚麻酸含量为O87meg；梅花鹿血蛋白中含有17种氨基酸，其中Leu和Asp的质量分数较高，分别为1490和1099，其中人体必需氨基酸(Val、Ile、Leu、Phe、Met、Thr、bs)占氨基酸总量的4472。通过单因素试验和正交试验优化酶解条件，综合考虑水解度和酶解产物对自由基的清除率，结果表明胰蛋白酶优于ASl398中性蛋白酶。确定胰蛋白酶酶解制备抗氧化活性多肽最佳条件为：酶浓度(酶：蛋白)为8，底物浓度(鹿血：水)为1：3，pH值为73，酶解时间为4小时，酶
4、解温度为56C；极差值反映出影响水解度和酶解产物对自由基清除能力的各因素排列顺序均为：pH值温度底物浓度酶浓度时问：此条件下的酶解产物对超氧阴离子自由基和羟基自由基清除率分别可达9163和9432，水解度为4432。酶解产物经SephadexG25和DEAE52纤维素柱层析纯化，得到带有较弱负电荷的抗氧化活性多肽；经高效液相色谱分析，该抗氧化活性多肽主要是以分子量为876Da，463Da，146Da的混合肷；氨基酸组成分析表明，纯化后的抗氧化活性多肽含有17种氨基酸，其中ku和Lys的质量分数较高，分别达到1716和1234，人体必需氨基酸(Val、Ile、Leu、Phe、Met、11lr、L
5、vs)的含量高达5274。动物抗衰老试验表明，所制备的抗氧化活性多肽可以明显减缓D半乳搪所导致的大鼠衰老。治疗组和模型组相比，血清的SOD活性差异极显著(PsubstrateconcentrationenzymesubstrateratiotimeThescavengingefficiencyoftheoutcomeon02。andOHreach9163and9432respectivelyundertheseconditions，degreeofhydrolysisis4432IsolationandpurificationhavebeenstudiedwithSephadexG一25and
6、DEAE52columnchromatogram，anti-oxidativepeptideshavingweakernegativechargearegottenThemolecularweightoftheantioxidativepeptidesaremainlyas876Da，463Da，146DaAminoacidanalysisindicatesthattheanti-oxidativepeptidescontain17kindsofaminoacidI_zuandtheLyscontentsarehigherrespectivelyfor1716and1234，humanbody
7、indispensableaminoacid(val，Ile，Leu，Phe，Met，Thr，Lys)canreach5274Animalexperimentofantisenilefunctionsshowsthat，theanti-oxidativepeptidescanslowdownsenilityinducedbyD-galactoseThecuredgroupiscomparedwiththemodel2沈阳农业大学硕士学位论文group，thedifferenceofsertllnSODactivityisextremelynotable(pBAD“3&3632163566396
8、938BBR148621826120752K180918367850481268362I【28400823080938086790502一I(379728108829381518392CEBAD“81郧790877“82517955R428459780165487Kl88549003893787338907K290548956904889328B74OHK387668846898188739023CEBADK488448713855289808714R288290496247309沈阳农业大学硕士学位论文由表14看出，正交试验结果表明，对水解度而言，极差值反映出影响水解度的各因素排列顺序为：p
9、H值温度底物浓度酶浓度时间；最佳酶解条件为A281C2D3E4，即酶浓度为8，底物浓度为1：2，pH值为75，酶解时间为35小时，温度为59。在此条件下酶解产物对超氧阴离子自由基和羟基自由基清除率分别为8352和9174，水解度可达4877。从酶解产物对超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除能力来看，极差值反应出各因素对酶解的影响排列顺序均为：pH值温度底物浓度酶浓度时间；最佳酶解条件为A2B=C1_D4E3，即酶浓度为8，底物浓度为1：3，pn值为72，酶解时间为4小时，温度为56。此条件下酶解产物对超氧阴离子自由基和羟基自由基清除率分别可达9163和9432，水解度为4432。综合考虑水解度和
10、酶解产物对超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除能力，五个因素对胰蛋白酶酶解效果的影响顺序一致，均为pH值温度底物浓度酶浓度时间。但是水解度和抗氧化活性多肽对自由基的清除能力并不存在完好的线性关系，A282ClD4E3中的酶解产物对自由基的清除率最高，水解度最高的一组却是A2BlC2D3E4。这说明水解度高，并不代表所产生的抗氧化活性多肽对自由基的清除率高，可能因为酶解所产生的抗氧化活性多肽片断有一定的差异。本研究选取A282C1D4E3为优化结果。3232ASl398中性蛋白酶酶解梅花鹿血制备抗氧化活性多肽的正交优化研究、表15的正交试验结果表明，对水解度而言，极差值反映出影响水解度的各因素排列
11、顺序为：底物浓度时间温度pH值酶浓度；最佳酶解条件为A481C4DEE3，即酶浓度为9，底物浓度为1：25，pH值为79，酶解时间为3小时，温度为51。C。在此条件下酶解产物对超氧阴离子自由基和羟基自由基清除率分别为8730和8238，水解度可达4472。酶解产物对超氧阴离子自由基的清除能力而言，极差值反应出各因素对酶解的影响排列顺序为：酶浓度时间温度底物浓度pH值；酶解产物对羟基自由基的清除能力而言，极差值反应出各因素对酶解的影响排列顺序为：酶浓度时间pH值温度底物浓度。结合酶解产物对超氧阴离子自由基和羟基自由基清除率，本组正交试验的最佳酶解条件为A381C3D4E2，即酶浓度为8，底物浓度
12、为1：25，pH值为76，酶解时间为4小时，温度为48C：此条件下所得酶解产物对超氧阴离子自由基和羟基自由基清除率分别可达9145和8351，水解度为4152。45第三章结果与分析表15ASl398蛋白酶酶解反应的正交试验结果Tab15ResultsoftheorthogonalexperimentofenzymatichydrolysiswithASl398试验号experimentnumberABCDE酶：蛋白()鹿血：水enzyme：protein()deerblood：water清除率()scavengingefficienc“)pH值时问(h)温度()DI-I()02一OHpHval
13、ue娜)tcmpcratu叫)1111113647876877412122223286903976A8345678910111213141516K1K2DHK3K4RK1K2n一K3K4RKlK2OHK3K444l32397l29444298314533492633415237j23048358244722863326735A934624142334733印33253356326236吣33603584363434JD9340538933793353831773629337732嬲27896528253350588228734869685748704869l86168684888687，948
14、8628730871985048820838886838665879984“47411805438237677，74808679，977840791079697873789479698004811978967927797679978004801l8048808l7955883286508294885986如89加91458588885588608730797985-4l830377048004801380，5l7891791983j18060806979，948238773279198126BDECAADEBCADBCE!：竺兰竺兰竺34432l214334l3434l243212143421
15、43341243234123412341231122223333444沈阳农业大学硕士学位论文。八：，2藿卜扎谷二图18SephadexG-25纯化抗氧化活性多肽的桂屠祈图Fig18Thechromatogramofanti-oxidativepeptideswithscphad“o甾gclcolumn注：设定的记录仪纸建为6cmth，t程为50mv，灵敏魔为0SA，紫外检涮仅的检测波长为280m梅花鹿血经蛋白酶酶解得到的酶解产物是各种肽和氨基酸等的混合物，本研究想制备提取具有抗氧化活性的肽类，所以本试验先采用分子筛层析的方法对其进行粗分离，以纯化得到具有抗氧化活性的组分。SephadexG25柱层析纯化抗氧化活性多肽的结果见图18。由图看出，梅花鹿血酶解产物经SephadexG25柱层析后，得到三个较明显的洗脱峰，其中第一个峰所占比例最大。同时，由图18也可以看出梅花鹿血酶解产物中肤分子的分布是连续的。第三章结果与分析宴50窑i40=30201023l56789101I121314151617譬号mer围19SephadcxG-25纯化抗氯化活性多肽各管的淆除翠Fig19The
