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1、2 0 1 1 年 7月中 J u l y 2 01 1 第 3 卷 第 2 O 期 、 b1 3 No2 O 中国中医药咨讯 J o u r n a l o f Ch i n a Tr a d i t i o n a l Ch i ne s e Me d i c i l i e I n f o r ma t i o n 6l 哺乳动物细胞灌注培养工艺研究进展 吕中华 李国军王锐 ( 哈药集团药物研究院。黑龙江哈尔滨。1 5 0 0 2 5) 随着动物细胞培养技术的不断改进， 灌注培养体系以其特有的优势取得了广泛的发展。 本文依据不同灌注培养 系 统的特点划分 分为微栽体悬浮灌注培养、悬浮细胞
2、截流灌注培养、流化床及 固定床灌注培养等几类，并对各类型的灌注体系进行了概述。 【 关键词 】 灌注培养； 微载体；细胞截留 随着单克隆抗体药物产业的发展 ，带动了大规模动物细胞 培养技术的不断提高。利用动物细胞生产单克隆抗体已成为当 前生物制药企业的发展方向。在上世纪六十年代， 灌注培养技 术的出现为动物细胞大规模培养开辟了广阔的前景。在随后的 研究中，灌注培养技术得到了迅速发展，已成为动物细胞大规 模培养的重要方法。灌注培养的主要优点是连续灌注的培养基 可以提供充分的营养成分，并带走代谢副产物，而细胞保留在 反应器系统中，由于细胞生长环境优 良，可以达到很高的细胞 密度 ，并延长表达时间、
3、增大收获体积，同其它方法相比，灌 注培养的产率可以提高很多。 1 悬浮灌注培养 1 1 微载体悬浮灌注培养 微载体培养最先是由A 1 L 1 V a n We z e l 提出，其方法是在细 胞培养时，将细胞悬液与经过特殊处理的微载体混合培养，待 细胞贴附于微载体上后移至培养液中培养 ，借助搅拌系统使细 胞随载体均匀悬浮于培养液中。近年来随着对微载体材料的深 入探索， 相继开发出液体微载体、 聚苯乙烯微载体、 P H E M A微 载体、藻酸盐凝胶微载体等，并有很多微载体 已进行商业化生 产， 如明胶微载体G e l i b e a d、 C u l t i s p h e r、 C y t
4、o d e x 3 和M i c m s p h e r e 以及大孔的C e l l s n o w 和C y t o p o r e 等。 1 2 悬浮细胞截流灌注培养 随着无血清悬浮培养技术的 E t 趋成熟 ，现有细胞密度及表 达量已不能满足需求，人们重新将 目 光转移到灌注培养上 ， 但 是如何不用微载体而将细胞截流在反应器中并结合无血清悬浮 培养工艺进行产物的表达成为热门。该工艺的重点在细胞截流 上 ，如何高效的截流细胞而不对细胞产生损害及降低堵塞成为 焦点。 1 2 1 中空纤维柱细胞截流装置 中空纤维柱是由若干根孔径在 1 0 k d - 0 4 5 u m的圆筒形膜束 捆绑在
5、一起构成的， 含细胞液由圆筒中间快速通过形成切向流 ， 因膜的孔径小于细胞直径，因此细胞被截流在膜内侧 ，而培养 液透过膜渗出到膜外侧而达到截流细胞的 目的。当前该种灌注 培养装置最具代表的就是 A T F S y s t e m( R e fi n e T E C HN O L O G Y) ， 其特有技术可有效防止柱体的堵塞 ，达到长时间截流细胞的目 的。 据报道， 应用该系统进行悬浮细胞培养密度可达 4 1 5 1 0 个， m l ，蛋白产量可达 1 g L d a y甚至更高。 t hr ou gh “ “ 图 1 A T F系统运行示意图 1 2 2 沉降法细胞截流 在众多的细胞截
6、留装置中，倾斜式重力沉降器由于设备简 单、对细胞造成的损伤较小、操作简易，已用于杂交瘤和 C H O 细胞连续灌注培养 ，在采用上流式沉降操作的连续灌注培养生 物反应器系统中实现了高密度培养。但该系统在进行细胞培养 时还存在诸如细胞损失、灌注流速过慢等问题而限制了系统的 放大，无法应用于商业化生产。 1 2 3 声学细胞截流装置 这是一种基于声频引起细胞聚集的新型细胞截留装置 ， B i o S e p声学细胞截流设备 ( A p p l i k o n)的原理完全是基于温和 的声频引起松的细胞积聚，然后再沉淀。与其他的细胞分离技 术相比，B i o S e p内的声频能量网构成一个 “ 虚拟
7、网” ，因而是更 好的，无接触、不移动的过滤模式。该技术可以进行长达数千 小时的连续培养 ，因而大大提高细胞密度、生产率并获得高的 产品质量。 1 2 4 离心细胞分离 该方法较为简单，即在无菌条件下利用重力离心分离细胞 与培养液 ， 但该方法使细胞受到的剪切力较大 ， 对细胞损伤较 大，另外 ， 对操作环境要求较高及离心机体积上的限制而无法 应用于大规模生产 ，仅在研究 中应用。 2 床层灌注培养 2 1 流化床培养 利用一些诸如磁、电场等技术手段将微载体局限于一定区 域内，细胞生长于多孔微载体内部 ，培养基在流通过程中不会 损失细胞 ， 该培养方式适用于贴壁依赖型细胞，具有培养基交 换快，
8、细胞养分充足的特点。 2 2 固定床培养 是将微载体固定于无菌容器内， 细胞贴附生长在载体上或 载体内部，进行培养液更换时 ， 微载体并不移动，可很大程度 上降低血清的用量。 2 2 1 中空纤维灌注培养 由于中空纤维培养系统具有类似于生理状态的纤维毛细管 模式和灌注式培养基循坏系统，既有利于高密度细胞在纤维管 壁和周围的停留、生长和增殖，也便于营养物质的供应和代谢 产物的转移， 近年来， 已被越来越多地用于杂交瘤细胞的体外 培养。 2 2 2 堆积床培养 该方式是将反应器中装配固定的篮筐，中间装填聚脂纤维 载体，细胞可附着在载体上生长，也可固定在载体纤维之间， 靠上搅拌中产生的负压，迫使培养
9、基不断流经填料 ， 有利于营 养成分和氧的传递，这种形式的灌流速度较大 ，细胞在载体中 高密度生长。 灌注培养操作的共同优点是 ： 细胞截流系统可使细胞或 酶保留在反应器内，维持较高的细胞密度 ，一般可达 1 0 7 1 0 9 个 m l ，从而较大的提高了产量 ； 连续灌流系统使细胞稳定的 处在较好的营养环境中，有害代谢废物积累较低 ； 反应速率 容易控制 ，培养周期较长 ， 可提高生产率 ； 产品在罐内停留 ( 下转第 6 0 页 ) 6 O 中国中医药咨讯 J o u ma l o f Ch i n a T_r a d i t i o n a l Ch i n e s e Me d i
10、 c i n e I n f o r ma t i o n 2 0 1 1 年 7月中 J u l y 2 0 1 1 第 3 卷 第 2 o 期 V l _3 No 2 0 程立红( 2 o o 7 ) 等主张以 r 针灸J治疗有许多优点 ， 包含 ： 5 2 1 针灸无毒、无副作用。 5 2 2 针灸可以对多系统调节作用。 5 2 3 针灸对慢性压力损伤的调节作用。 5 2 4 针灸对神、气、血有帮助。 5 3 针刺的调神基础： 5 3 1 微针通其经脉，调其气血。C 灵枢九针十二原) 5 3 2 节之交、三百六十五会 ，所言节者，神气之所游行出人 也，非皮肉筋骨也。 灵枢九针十二原) 5
11、 - 3 -3 上守神者 ，守人之血气有气不足，可补泻也。神客者， 正邪共会也。神者，正气也。t 灵枢小针解) 5 3 4 神者，水谷之精气也。( 灵枢平人绝谷) 5 3 5 血气者人之神( 素问 八正神明论) 5 3 6 营卫者精气也， 血者神气也 ， 故血之兴气， 异各同类焉 枢营卫生会) 5 3 7 血气已调，形神乃持。( 灵枢痈疽) 。 5 _4 针灸调神临床的 r 情志因素 j辨析： 5 _4 1 先了解 r 病史j ：难度原因 5 4 2 观察 r 整体神态j ： 整体、眼光、表情、表述 5 4 _3 症 状特点 5 4 -4 综合个案特质 ：职业、年龄、文化程度、生活习惯、个 性
12、特点、个人需求程度、营造良好环境、和谐医患关系。 5 4 5 应用范围： 郁症、焦虑、癫痈、 慢性疲劳、性功能障碍、 反复感冒、 高血压、痛症、痹证等。 5 5 治疗郁症的针灸方法 5 1 主穴：水沟、百会、内关、神门、太冲 5 -2 配穴：针对症状特性 5 2 1 肝气郁结型：气滞胸闷( 实证) 治则：疏肝解郁、调情醒脑 处方 ：百会、印堂、四神聪、太冲、期门、r 胸闷J 加膻中； r 胁肋痛J加支沟、阳凌泉 ；r 脘嗳气 j加内关、中脘；r 月经 不调 j加三阴交、地机。 5 2 2 气郁化火型：阴虚内热( 实证) 治则 ：解郁清肝，祛火安神 处方 ： 百会、印堂、四神聪、行间、风池、 r
13、 胁胀痛J 加其 门、 r 胆火大 j 加阳陆泉 ， 侠溪( 胆) 、行间佣： ) ，去肝胆之火。 r 便结嘈杂冷 加章门、脾俞。 5 2 -3 心神失养型：( 虚证) 治则：疏肝、解郁、宁心安神、治阴虚内热 处方：神庭、四神聪、神门、内关、三阴交 5 2 4 心脾两些型( 虚证) 治则 ：健运脾 胃、养血安神 处方 ： 心俞、 神门、 通里、 脾俞、胃 俞 、 太冲、 r 脾胃处弱 j 加足三里、中脘 ； r 肺郁 J 加期门、r 神疲乏力 j 加关元 ； r 失眠 甚重者J加百会。 5 2 5 痰气郁结型：( 实证) 、 治则 ： 行气化痰、疏肝解郁 处方 ：丰隆、期门、肝俞、 膻中、内关
14、。 r 咽中有物 j 加天 突、照海、扶突、合谷； r 精神抑郁 J加百会、印堂。泻期门、 肝俞解肝郁；泻丰隆涤痰毒；针内关膻中实胸利气。 5 2 6 阴虚火旺型：( 虚证) 治则：滋阴补肾、清热安神 处方：肾俞、志室、太溪、勇泉、百会、人中、大陆、大 椎。 r 盗汗J 加复溜 ， r 易怒J 加肝俞 ， r 五心烦热 J 加劳实。 r 心 烦失眠 J加神门。复溜、太溪可滋补肾阴；泉源为井穴可泄肾 之虚火；百会可以脑窍、补益髓海、清虚安神。 7 结语 综合言之，忧郁症、郁症病患在二十一世纪经济危机、资 讯爆增、工作压力加大之下，有逐渐扩张的趋势，目前已列为 本世界第二大的疾病 。 情志影响人的
15、健康由先秦的老子、庄子、 苟子、孔子、汉朝张伸景、元朝朱丹溪、明代张景岳，到当代 的广州中医药大学的徐志伟、陈昱辉、张宏 、郑照顺等都持续 研究治疗与预防的策略。其治疗的方法：( 1 ) 可采用中药治疗( 2 1 针灸治疗( 3 ) 西医治疗( 4 ) 心理治疗( 5 ) 音乐治疗等。忧郁症的预防 方法可采用( 1 ) 自然医学 ：接触阳光、定时运动、饮食均衡( 2 ) 心 理压力的调节方法：减轻压力、化解压力、调节好心情、重视 人际关系( 3 ) 建立三级预防的心理、医学、社会、机制：首先给 予健康心理环境、物理环境，其次选出压力危机群及早辅导与 治疗；对于重病者结合医疗单位、社会单位、家庭给予当事人 最大的协助 ， 及复元周遭受影响者的健康。 中医对于郁症的治疗是人性化、 整体观； 但可结合当代 r 心 理学 J 、r 西方医学J的研究成果，达成 r 身心兼治j是最佳的 策略。 情志郁症主要参考书目 【 1 王彦叵。实用中医精神病学。台北：知音出版社，2 0 0 3 ； 2 】李茂德。忧郁症中医诊断基准研究。台中：中国医药大学中医学系 出版 ，2 o o 5 ； 【 3 何裕民。中医心理学临床研究。北京 ： 人民卫生出版社， 2 0 1 0 ； 4 】林嘉发。 中医切诊特定痛点与忧郁症严重程度之机关性研究。 台北： 长庚大学中医研究所硕士论文 ， 2 0 0
