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1、 Analyst 软件应用培训教程Analyst 软件应用培训教程关于本教程的说明：本教程为AB Sciex公司为在中国使用的客户培训的辅助材料。本教程仅提供给经过AB Sciex公司培训合格的操作人员使用。本教程内容仅限于Analyst 软件基本操作和应用部分。本教程提供的分析方法仅对用户起参考作用。本教程解释权在AB Sciex公司。目录1、定量分析简明流程2、成功定量分析应注意的问题3、定性分析原则与方法4、LC-MS 实验经验与仪器维护常识5、Analyst 软件操作简介：Calculator 功能与使用Library 功能与使用部分Script 功能与使用其他6、Analyst 软件
2、QTRAP 功能基本操作简介：QTRAP 扫描速度的校正QTRAP 系统的扫描方式QTRAP 系统IDA 指南7、部分化合物液质分析参考方法和信息8、压力单位转换表LC-MS/MS 定量分析简明教程首先确认仪器已经校准，气体、电压工作正常一溶液配制分别将待分析化合物的标准物质配制成110 ppm (110ug/ml) 的溶液，用于注射泵连续进样，以优化质谱参数。二Q1 Scan ，确定母离子a选择或建立Project 建立一个新项目 (Project)： 点击ToolsProjectCreat Project，出现下图对话框，键入项目名称，点击“Add All”添加项目功能，点击OK，完成。b
3、. 硬件配制：激活MS 主机，如果是API2000、3200，硬件配置文件中的质谱主机中应选择Integrated Syringe Pump 。c. 进入MS 的Manual Tuning 界面，并设置注射泵流速510ul/min 。d选择质谱扫描方式：Q1 Scan，设置扫描范围(应包含待分析的化合物)；根据化合物性质，选择扫描极性e手动调节DP、GS1 等参数，使喷雾平稳、待分析化合物信号灵敏度较高fMCA on ，点击Acquire，采集并存储2050 张加和图谱(根据灵敏度)，并保存方法，例如：Q1.dam g在质谱图区域，点击右键“Open File”打开图谱，局部放大，确定母离子的
4、质荷比，准确到0.1amu 。，如下图，母离子m/z 应为609.3。三Product Ion Scan ，确定子离子以第一步测得值为母离子，做Product Ion Scan（MS2），手动调节CE 等参数，使母、子离子都具有一定强度，一般以母离子的强度占图谱中基峰强度的1/3 到1/4 为宜。MCA on ，点击Acquire，采集并存储2050 张加和图谱，并保存方法，例如：609-MS2.dam。在质谱图区域，点击右键“Open File”打开图谱，选择2 个最高的子离子，如上图中，选择195、397，局部放大，确定子离子的质荷比，准确到0.1amu， 则上面两个子离子为195.2、3
5、97.3。四MRM，优化质谱中与化合物相关的参数以前两步选定的母离子、子离子，组成离子对，例如609.3/195.2，609.3/397.3 等，做MRM Scan，每个离子对的分析时间100 或200ms。通过Edit Ramp ，分别优化Compound 项下的各参数，如DP、EP、CE、CXP 等：点击Edit Ramp ，选择要优化的参数点击OK，出现该参数的优化窗口，可以根据需要改变该参数的优化范围(Start、Stop)和优化步长(Step)。不同参数需逐一优化。然后保存方法，例如609-MRM.dam。同样步骤，优化需要分析的另外化合物，分别保存方法。五、将MRM 方法转化为液质
6、联用方法关掉所有质谱分析界面，将现有质谱体系灭活，激活液相色谱、质谱设备。单击Acquire 中Build Acquire Method ，打开上面保存过的MRM 方法，右键显示方法左边导引条中第一行Acquire Method，点击Add/Remove Device Method 添加设备：色谱泵、自动进样器选中方法左边导引条中第一行Acquire Method 参数页，设置色谱同步。设置色谱参数，分析时间一般为0.81min ，流动相组成和流量与实际样品分析时相同；修改质谱分析时间 (Duration ，一般设置0.81min) ，与色谱参数一致；设置GS1、GS2、TEM 初始值为40、
7、40、400 左右，保存方法，例如：LC-MRM.dam。六、源参数优化将上面用过的样品溶液稀释1001000 倍。在Tune 项下，双击 Quantitative Optimization ，选择FIA 分析，根据向导进行自动优化。注意：需要优化的各可选值之间用“;”分隔。七色谱条件优化接好色谱柱，关掉Tune ，在Acquire 栏下调出上一步优化好的方法，根据色谱柱规格和待分析体系的复杂程度设置液相色谱分离和质谱分析时间，或编辑洗脱梯度，保存方法。用新保存的方法平衡色谱柱，平衡时间为510 倍柱体积。色谱柱充分平衡后，设置Batch 进样，观察色谱峰形及保留时间是否合适，根据具体情况，调
8、节流动相，优化色谱条件。用空白提取液配制同样浓度标样，按上面方法进样，观察色谱峰形及保留时间是否合适，峰高有无变化，有无离子抑制现象，否则调节流动相，进一步优化色谱条件。注意：等度洗脱，样品之间不需要再平衡色谱柱，若为梯度洗脱，则进下一针样品前色谱柱一定要充分平衡。八工作曲线制备用空白提取液配制一系列不同浓度化合物的混合标样，按上一步方法，设置Batch 进样，例如，分别稀释浓度为0.1 g/ml、0.2 g/ml、0.4 g/ml、0.8 g/ml 和1.6 g/ml 的混合标准溶液等。根据项目分析要求，有时也可只做单点校正，而不做多点线性。将采集的数据，根据峰面积，做标准曲线。根据检测项目
9、要求，进一步考证方法的最低检测限、重现性、样品提取回收率等性能参数。成功定量分析应注意的问题一、准备工作1. 查阅文献2. 做好样品前处理，萃取、浓缩、分离、纯化等3. 有条件的可先在HPLC 上摸好LC 条件，能够基线分离更好，注意缓冲体系应符合MS 的要求4. 溶剂(包括水)的纯度，最好色谱纯以上5. 新的色谱柱可能要先冲洗很长时间才能干净，某些样品非常容易吸附在进样阀和管路中，应及时用溶剂清洗6. 质谱仪须校准，预热时间要足够长，气流的稳定也很重要，液氮气阀开度要注意，达到稳定程度二、MS 条件优化先定性后定量1. 首先，根据待分析化合物的性质，确定离子化方式： ESI or APCI，
10、POS or NEG 2. 用1-100ppm 的纯样，Q1 SCAN 察看存在哪些离子，要能够看到待测的母离子，应明显比周围的噪声离子高，通过改变DP，观察离子的增减，若为POS 方式，看M+1，M+18，M+23 等等，初步判断分子离子，如看不到则可能是浓度太低或离子化方式不合适，或选择的溶剂体系不合适。3. 母离子选M+H，或M-H 最好，但有时只有M+NH4，M+Na 等，此时CAD 能量可能需要高些。选择M+H+，还是+NH4，+Na 等，要由化合物决定。加合离子若稳定，则可用，不稳定则可能需要更换流动相，但+H 的离子通常好些，所需碰撞能量低，灵敏度高；如含Cl 可选择2 个母离子
11、峰。4. SIM 与MRM 方式的选择：单级Q 只能SIM，MRM 可看成2 个SIM，选择性更好。5. 再根据上一步确定的母离子进行Product Scan，确保所有碎片离子都来自待测化合物，而不是溶液中的杂质，找出较强的碎片离子信息。通过改变CE， 从中选定MRM 需要测定的一对或更多离子对，为最后LC-MS/MS 联用做准备。6. 做Product Scan 时，注意小数点后的位数。MRM 离子对信息输入准确，灵敏度才会高。7. 先多选几个离子对，待出现基质干扰时可换，最后根据法规要求确定离子对数目。8. MRM 方式优化仪器，通过优化仪器参数，使得母、子离子都达到一定强度水平，使MRM
12、 灵敏度最高。可先让仪器自动优化参数，然后再手动细致优化，只检测一对离子时根据TIC 的强度来确定仪器参数，一次优化多对离子时，要根据每对离子的XIC 强度来分别确定仪器参数。9. 先用注射泵优化Compound 项下面的参数，如DP、CE 及CAD 等，再接通LC，用FIA 优化其他参数如温度，气流和IS 电压及离子源位置，或接一个三通，样品仍由注射泵进入离子源，同时LC 保持需要的流量。然后进行MRM 测定。10. Curtain Gas在不降低灵敏度情况下尽量大些，温度在达到灵敏度时不用太高，气流也不用太大，这样可以提高信噪比，保持信号稳定。11. 分辨率的选择：当样品较纯，Q3 可选L
13、OW，提高灵敏度，若选LOW 后本底噪声太高则意义不大。三、LC 条件优化：1. 色谱柱长度可根据分离的要求而定，定性可长些，定量在能有效排除干扰情况下尽量短，提高效率；内径最好选细径柱如2mm、1mm，IS 可不分流，4.6mm柱用1ml 流量时如不分流灵敏度还不是最佳，不如流量低时更好。流速高，峰形好。2. 不同牌号色谱柱，效果很可能不同。3. pH 的影响：正离子方式pH 要低些，负离子方式pH 要高些，除对离子化有影响外，还影响LC 的峰形，以至定量误差。流动相加乙酸铵可适合大部分测定要求。4. 用流动相配制标样，初步优化确定LC 条件是否合适。5. 标准品工作液现配现做，尤其是较低浓
14、度，时间长了可能因吸附分解等降低。6. 进样顺序要先稀后浓。7. 洗针液要常换，进过浓样后要进一针空白，检验是否有残留污染。8. 顺序：纯样-添加样-实际样品。9. 流动相配制的标准品溶液优化后，用空白提取液配制标准品再次优化，考察干扰情况，空白添加再提取后，考察回收率。10. 用空白提取液配制标准样品做工作曲线，可以有效排除干扰因素。四、前处理方法的优化1. LC，MS 都优化过，还是达不到灵敏度要求或无法检测，需要改进提取方法2. 离子抑制：改变前处理方法或LC 条件3. 内标用法，药代动力学时多采用内标，选择原则：内标物与被测物的化学性质有区别时，要注意干扰基质对他们的离子化影响的不同，
15、尽量选同系物。还可利用同位素标记的同一化合物作为内标。4. 衍生化：有时有助于使信号增强，且稳定，例如硝基呋喃类，衍生化后容易测定。五、数据处理1. 最低检出限，信噪比3:1，定量限10:1 2. 同一物质几对离子的比例应相对恒定，误差不超过15%峰面积，比使用峰高定量准确3. 当浓度低，信号弱，自动积分不准时，可对峰面积手动积分4. 平滑次数与峰宽因子、保留时间等设置都会影响积分值5. 曲线过零点时，可用4 个点；不用，则需要5 个点6. 线性范围太宽，有时意义不大定性分析原则与方法一、准备工作1. 核对样品名称、编号2. 通过询问样品提供人，查阅文献等，了解样品其他知识，例如熔点，沸点，溶解性等理化性质以及样品来源、合成路线、光谱、波谱数据等3. 可能含有的杂质，样品大致含
