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1、哈尔滨医科大学博_学位论文肤核酸抑制胃癌SGC7901细胞端粒酶活性的研究摘要目的:与传统反义试剂寡核普酸(S-ODN)相比，新开发的肤核酸(PNA)具有诸多优点，但较低的细胞摄取率在很大程度上限制了它在分子生物学领域的应用。本文探索一种有效的方法增加PNA白勺细胞摄取率，继而在细胞培养抑制实验中，评价PNA通过封闭端粒酶模板(hTR)而抑制胃癌细胞SGC7901增殖的效果、比较PNA与S-ODN的抑制效果、探讨Pi!对端粒酶活性表达的抑制作用机制和这种新兴的端粒酶介导抑癌途径的潜在价值。方法:PNA与相应的寡核昔酸杂交形成杂交复合物，经脂质体Lipofectamine2000包裹后，转染胃癌
2、SGC7901细胞，测定转染率筛选PNA的最佳作用剂量通过细.胞克隆形成抑制实验及细胞生长抑制实验来观察细胞水平抑制效果及细胞形态学变化采用聚合酶链反应一酶联免疫反应(PCR-ELISA)和银染法在分子水平检测细胞端粒酶活性的变化逆转录聚合酶链反应(R下一PCR)方法检测hTR基因及端粒酶逆转录酶(h丁ERT)基因的表达附加流式细胞术(FCM)观察细胞的凋亡情况。结果:转染前杂交并经脂质体介导的方法能够提高PNA的细胞摄取率，转染率达68.1%oPNA的最佳作用剂量约为IOOnM。第3天即可发现AP-D-L组细胞端粒酶活性明显被抑制(P1.54A450nm-4A690nm单位，减去阴性对照A值
3、平均值后，样品的4A值0-2乙A450nm-乙A690nm单位的被认为是端粒酶阳性。6、凝胶显带:配制10%非变性聚丙烯酞胺凝胶，取PCR产物5u!加入2u1加样缓冲液(澳酚兰二甲苯青蓝)混匀，加入各泳道，120V，电泳4-6小时，电泳液为1X丁BE.将凝胶转入500mI银染固定液(10%乙酸钠，0.5%乙酸)中振摇10-12分钟，去离子水反复漂洗凝胶3次。用银染液(0.2%AgNOO浸染凝胶10分钟，去离子水反复漂洗，再将凝胶置于显影(1.5%NaOH0.4%甲醛)中显色10分钟，待DNA条带显示清楚后，结果扫描仪下存图保留。八、OnestepRT-PCR检测hTR和hTERT基因表达于细胞
4、培养瓶中重复实验六(仅含有AP-D-L组和对照组)，分别于药物作用后第3142536夭(根据生长曲线选择的生长曲线变化关键点)检测hTR和hTERT基因表达。1、SGC7901细胞总RNA提取采用下Rlzol试剂从细胞中提取总RNA，在，Oom培养瓶中旺盛生长的细胞中加入lmlTRlzol试剂，室温下放置5分钟加入。.2m1氮仿，剧烈振荡15秒后，室温下放置2-3分钟41C12000Xg离心，5分钟，将上层液移至一干净Eppendorf管中，加入0.5ml异丙醇，混匀后室温下放置10分钟。40C12000Xg离心10分钟，弃上清，75%乙醇清洗RNA沉淀40C7500Xg离心10分钟室温下干燥
5、哈尔滨医科大学博_学位论文肤核酸抑制胃癌SGC7901细胞端粒酶活性的研究RNA沉淀5-10分钟。RNA沉淀溶于10PIRnase-free水后于一70保存。部分提取液于含澳化乙锭的琼脂糖凝胶电泳中检样(应检测到28s18s和5s三条带，并且前两者明显，后者不明显为最佳)。2DnaseI处理总RNA(表2)表2.在1.5mlEppendof管中加入:RNA200mMVRC2.5ug2.5t10XDnase!Buffer5.0uDnase0.511DEPC-treatedwaterTotal42.011I50u37温育1小时，加入150uI的丁Rlzol试剂，充分混匀，室温下放置5分钟。加入40
6、PI氯仿，剧烈摇匀15秒，室温下放置2分钟。40C12000Xg离心15分钟。上清液移入新的印pendorf管中。加入1001i!异丙醇，混匀，室温下放置5-10分钟。40C12OOOXg离心10分钟。弃上清，75%乙醉清洗沉淀。RNA沉淀溶于10uIDEPC处理水中。3RT-PCR扩增表3扩增体系1.5p!4.0pI50uI10XOne-stepBufferdNTPMixtureRNaseInhibitor(40UuI)耐热试剂GC-Melt01igo(dT)primer50RT-TITANIUMEnzymeMixPCRprimermixture(40iaM)DEPC-treatedwate
7、rTotal种，种钾.口.种种种种户.户叫扩增条件5.0itI1.0uI0.5u!25.0u!10.0u!1.0uI1.0u1.0u一、500Clhour、940C5min、940C30sec、520C30sec哈尔滨医科人学博is学位论文肤核酸抑制胃揣SGC7901细胞端粒酶活性的研究、680C1min、一repeat30circles、680C2min、40Creserve4琼脂糖凝胶电泳扩增DNA产物与加样缓冲液混合后，2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果并照相存图。九、流式细胞仪检测将处于对数生长期的6瓶SGC7901细胞，消化稀释吹打，并混合在一个培养瓶中，进一步充分吹打，使成为单细
8、胞悬液。均匀分成12瓶，置于培养箱，培养24h后，随机取3瓶细胞收集准备做CM检测，其余9瓶弃去培养液加入浓度为100nmolLPNA全培养基3m1，随机分成三组，继续培养。于1425和36天(根据生长曲线选择的生长曲线变化关键点)时分别收集细胞准备做CM检测。实验步骤:1)将实验的细胞弃去培养基，PBS冲洗后用0.25%胰蛋白酶消化3-5min，用培养基吹打，收集到离心管中。2)用1000g分离心10min。弃上清，用70%冷乙醇固定备用。3)将各实验时IB收集的乙醇固定的细胞悬液，用1200g分离心15min，分别用PBS配成1X10smI个的细胞悬液。4)PI染色配制:PI15mg，构概
9、酸钠0.1gNP-400.3mI，加蒸馏水至100m1，4C避光保存。5)将等体积的细胞悬液和PI染液混合，4放置20-30mino6)测定前将样品用300目尼龙膜过滤。7)将样品加入CM的样品室，以激发波长488nm测定，并记录实验结果。十、统计学分析:计量数据t检验、计数数据x检验。哈尔浓1)科人学i(+口洲住论文肤核酸抑制胃痛SGC7901细胞端粒酶活性的研究2.PNA最佳作用剂量的选择最佳作用浓度:100nM(表4)Table4.SelectingoptimalconcentrationofPNAAP-D-L(nM)clones50100200400800Mean64.731.512.
10、394.4ContrastInhibitive51.313.179.980.985.993.2rate(%)3.PNA对SCG7901细胞克隆形成的抑制:40天后终止培养，计数细胞克隆形成平均数和克隆形成率(图11):AP-D-L组，7.51.9%S-L组.63.015.8%AP-D组，142.236.5%MP-D-L组，165.741.5%L组，182.345.6%B组，194.148.5%。采用t检验进行统计学处理:AP-D-L组与S-L组差别显著(tn。一。一1ssL=2.674to(oPP0.05)与其它组别比较中P-0PO.01=。并观察到AP-D-L组细胞区别于其他对照组的明显的细
11、胞形态学方面的变化，S-L组只是细胞密度上的变化，并没有发现细胞变圆，细胞膜收缩、核浓缩于核膜等细胞形态的变化(图12)。生长曲线中这种差异非常直观:从作用后第18天开始AP-D-L组和S-L组细胞数量的增长速度与其他四组相比明显下降，AP-D-L组在第24天左右达到高峰，其后的16天中细胞数量逐渐减少，至实验结束时其数量已接近于基数而S-L组细胞在其后16天中呈现比较缓慢、但仍是上升的趋势。端粒酶活性的检测中发现药物作用后第3天，即可检测到AP-D-L组和S-L组端粒酶活性被抑制，至第36天AP-D-L组始终为阴性，而S-L组已转为弱阳性。故S-ODN的抑制为时间一剂量双重依赖模式，而PNA
12、的作用更似剂量依赖模式，即在细胞的抑制中，S-ODN需要维持其作用浓度才可能取得好的效果，而PNA在适量的浓度下只需作用一次。这些结果与PNA和S-ODN的特性、在细胞中的半衰期应该有密切的关系。这对以后动物实验的开展有非常重要的指导意义。四、封闭hTR的抗癌机制探讨一细胞生长抑制的“滞后期”实验中证实了端粒酶途径抑癌过程中的“滞后期”(lagphase)的存在。哈尔滨医科大学博!学位论文肤核酸抑制胃癌SGC7901细胞端粒酶活性的研究在PNA最佳剂量选择实验的设计时，我们想到MTT实验，但是发现并不可行，接种细胞至96孔板中细胞长满时(大约2天)还未发现实验组和对照组!050有何差异，MTT
13、实验的放弃使我们意识到端粒酶途经杭癌井不是像传统的抗代谢等类药物，它的显效期可能会相对长一些，其后的实验证实了这点。在生长曲线中，SGC7901细胞在PNA作用后的16天内其细胞形态和细胞数量与对照组并无显著差异，17-24夭时细胞分裂的速度下降，24夭以后几乎停止分裂，看不到分裂相细胞，其后细胞数量逐渐减少，至40夭时细胞数量接近于基数。然而在实验过程中动态检测细胞端粒酶活性发现，药物作用后3夭时AP-D-L组细胞端粒酶活性检测结果为阴性。至第36天时AP-D-L组有轻度降低趋势，但均为阴性。即在SGC7901细胞端粒酶活性受到抑制后，并不会立刻出现细胞水平的变化，本实验中这两者之间大约间隔
14、20-30天，这就是所谓的细胞水平的变化滞后于细胞端粒酶活性的被抑制。那么如何解释这个滞后期存在1、细胞末端端粒的长度:Herbert1，等人在1996年应用S-ODN在三个端粒长度不同的乳腺癌细胞系中观察端粒酶抑制剂S-ODN的效果，HME50-5E最-qDU145居中，HME50-5E-hTERT较长，实验中发现当HME50-5E组细胞停止分裂时，同时停止三组细胞的药物作用，后两组细胞又可以逐渐恢复其端粒长度，一直分裂下去。这一结果表明S-ODN抑制作用的时间一剂量依赖模式，同时暗示它对细胞增殖能力抑制的程度似乎由细胞端粒的长度决定。1999年，Shammas等人q在PNA的实验中也有类似
15、的发现。我们已知人类细胞端粒的长度通常在10-20kb，肿瘤细胞的端粒将更短一些，每次细胞分裂端粒将短缩50-200b，在端粒酶被抑制的情况下，按最短的端粒长度和最大的每次细胞分裂损耗计算，肿瘤细胞最少还有大约30-60次的分裂能力，本研究中的SG07901细胞的分裂周期为12小时代，那么这个滞后期是比较吻合的。这可能是它的最好的解释。遗憾的是我们并没有做检测SGC7901细胞端粒长度的I作，但有文献报道:胃癌SGC7901细胞端粒酶长度为4.08kb(2002)11141哈尔滨医科大学博学位论文肤核酸抑制胃癌SGC7901细胞端粒酶活性的研究那么这个滞后期最短可为10-20次。这是我们今后继
16、续研究的方向之一。2、端粒末端“下环”结构的存在:最新的研究发现，端粒的末端会形成一个被称为“丁环(CTloop)”的结构，这一结构已在人类、鼠、原生动物中被分离出来。并且在人类和鼠中端粒的T环结构的大小与端粒长度有关，人类淋巴细胞中构成丁环所需碱基约3k6、小鼠肝细胞中约18kb，表明下环的大小具有种系和细胞特异性的，它的最小形成长度约为1kb。那么，它的存在将使滞后期在一定成度上缩短，但随种系和细胞特异性而有区别。这也是我们今后继续研究的方向之一3、对通过端粒酶途径抑癌应用的几点设想:与那些在操作后几小时、几天即可达到杀伤细胞作用的传统的抗增殖试剂相比，从端粒酶受抑制到端粒长度短缩至足以对细胞产生明显抑制作用之间，有一段潜伏期，这一潜伏期大约为30-60个细胞周期，也就是说抗端粒酶治疗的抗肿瘤作用要在端粒酶活性抑制后1个月左右才出现，这个相对的滞后期的长短取决于细胞端粒的长度，可能不会有立竿见影的效果，尤其是在那些端粒较长的癌症中。因此目前情况推断，这种方法的应用有可能成为一种有效的癌症治疗的辅助疗法。滞后期的存
