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1、中南民族大学 硕士学位论文 水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)的精细定位及候选基因的克隆 姓名：杨青 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：刘学群 2010-05-27 中南民族大学硕士学位论文 I 摘 要 水稻白叶枯病（Bacterial Blight, BB）是一种严重的细菌性病害。自 1884 年 在日本第一次被发现以来， 水稻白叶枯病已在南纬 20 度至北纬 58 度的世界范围 内被观察到。在我国，除新疆外，各稻区均有发生，华东、华中和华南发生普遍。 引起水稻白叶枯病的黄单胞杆菌(Xanthomonas oryzae pv. Oryzae，Xoo) 为革兰氏 阴性菌
2、，它通过气孔或伤口入侵宿主木质部（维管束）进行繁殖，沿叶脉产生灰 褐色至白色病斑。 由黄单胞杆菌引起的水稻白叶枯病在流行年份可导致水稻减产 2030%，严重时高达 50%。 到目前为止，已被确定的水稻白叶枯病抗性基因至少有 36 个，23 个显性基 因，13 个隐性基因，编号已排到 Xa36(t)。王春台等在云南地方品种扎昌龙（Za Chang Long，ZCL）中发现了一个新的抗性基因，并命名为 Xa31(t)，定位于水 稻 4 号染色体的 G235 和 C600 两个分子标记之间，物理距离相差 100 Kb。本研 究对 Xa31(t)进行进一步精细定位，筛选克隆目的区域的候选基因。获得了以
3、下 主要研究结果： 1. 构建了一个含有 294 个单株的 ZCL/IRBB1 的 F2代群体， 根据目的基因在 染色体上的目的区域，以 NCBI 公布的水稻品种日本晴(Oryza Sativa L. SSP. Japonica cv. Nipponbare)基因组序列为基础，选取相应的 BAC 或 PAC 克隆，在 各克隆均匀选取序列片段，与水稻 9311 (Oryza Sativa L.SSP. Indica)基因组序列 进行 BLAST 比对，找到无同源或同源性较低的区域，用 Primer5.0 共设计 PCR 引物 46 对。 最后筛选到 5 对多态性 PCR 分子标记， 用于对作图群
4、体的遗传分析。 将 Xa31(t)进一步定位到约 20 Kb 内。 2. 在抗性基因Xa31(t)的目标区域，根据网上公布的日本晴的基因组序列， 用生物信息学的方法预测候选基因，然后对候选基因进行BLAST分析，根据含 有水稻白叶枯病抗性结构域和ORF，确定了5个候选基因。对这5个候选基因设计 引物，进行长片段PCR扩增，得到了两个候选基因的全长序列，构建TA克隆载 体进行测序，筛选正确的克隆；以pCMABIA1300构建的表达载体，转化水稻感 病品种日本晴和台北309, 已获得了部分阳性植株，其抗性正在鉴定之中。 水稻白叶枯病抗性基因 Xa31(t)的精细定位及候选基因的克隆 II 关键词：
5、水稻白叶枯病；Xa31(t)；精细定位；候选基因；遗传转化 中南民族大学硕士学位论文 III Abstract Bacterial blight (BB) of rice is a kind of serious bacterial diseases in rice. Since it was first found at 1884 in Japan, BB has been observed in worldwide rice-planting area from the south latitude 20 degrees to north latitude 58 degrees. In C
6、hina, BB occurs in every rice planting areas except Xinjiang Province. BB is caused by a kind of Gram-negative bacteria, Xanthomonas (Xanthomonas oryzae pv. Oryzae，Xoo) through the stoma or wound xylem (vascular bundle) of host rice plant to reproduce taupe and white disease spot along leaf vein tur
7、ns. .Rice bacterial blight disease can cause the 2030% loss of rice output in pop year, even up to 50% in serious occurring year. Up to now, there are at least 36 BB resistance genes, 23 dominant genes and 13 recessive genes, in rice have been identified, Wang et al. discoered a new resistance gene
8、named Xa31(t) from ZCL, a regional rice variety from Yunnan province in southwest China. It was mapped on rice chromosome 4, between G235 and C600 the two molecular markers, and the Physical distance is 100 Kb. The aim of this research is to further make a fine map of Xa31(t) and to clone its candid
9、ate genes. The main results are as follows: 1. A F2 population with 294 individual plants from a cross of ZCLIRBB1 has been constructed. Fouty six pairs of PCR primers disigned by PrePrimer 5.0 based on sequence of Nipponbare and 9311 genomes within the mapped target gene (Xa31(t) region on chromoso
10、me 4 are used for polymorphic analysis between the two parents of ZCL and IRBB1, and 5 pairs of polymophic PCR molecular markers has been selected. Using these 5 markers screen the 294 individual plants of the F2 population from a cross of ZCLIRBB1. Genetic analysis are finally limiting Xa31(t) with
11、in a region of about 20 Kb. 2. According to the sequence of about 20 Kb in the region of resistance gene Xa31(t) located in the Nipponbare genomics, 5 candidate genes were predicted by 水稻白叶枯病抗性基因 Xa31(t)的精细定位及候选基因的克隆 IV bioinformatics analysis. and full-length cDNAs of 2 candidate genes had been obt
12、ained from ZCL. The ORFs of two candidate genes were recombined with the expression vector pCMABIA1300, respectively and introduced into rice callus of Nipponbare and TB309 by the means of Agrobacterium-mediated transformation. A few of positive plants have been identified and the resistance analysi
13、s on these plant are being studied now. Key words: rice bacterial blight; Xa31(t); fine mapping; candidate gene; genetic transformation 中南民族大学硕士学位论文 V 英文缩略语及英文对照 AC-DS activator-dissociation systern 激活因子-解离系统 Amp Ampicillin 氨苄青霉素 BAC Bacterial Artificial Chromosome 细菌人工染色体 BB Bacterial blight 白叶枯病 b
14、p Base pair 碱基对 cM centimorgan 厘摩尔 ddH2O Double distilled water 双蒸水 dNTPs Deoxyribonucleoside triphosphate 脱氧核糖核苷三磷酸(4 种) E.coli Eschericia coli 大肠杆菌 EB Ethdium bromide 溴化乙啶 EDTA Didodium ethylenediaminetetra-acetate 乙二胺四乙酸 EST Expressed Sequence Tag 表达序列标签 GTS glutathione S-transferase 谷胱甘肽 S-转移酶 H
15、R hypersensitive response 过敏反应 IPTG Isopropyl -D-thiogalactoside 异丙基 -D-硫代半乳糖苷 Kan Kanamycin 卡那霉素 kb Kilobase 千碱基 LB Luria broth LB 培养基 LRR Leucine-rich repeat 富亮氨酸重复序列 LZ leucine zippers 亮氨酸拉链 mg Milligram 毫克 min Minute 分钟 mL Millilitre 毫升 mol Molar 摩尔 NBS nucleotide biding site 核苷酸结合位点 OD Optical
16、density 光密度 水稻白叶枯病抗性基因 Xa31(t)的精细定位及候选基因的克隆 VI ORF Open Reading Frame 开放阅读框 PAC P1 Artificial Chromosome 源于 P1 的人工染色体 PAMP Pathogen-associated molecular pattern 病原相关分子模式 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 PRRs pattern recognition receptors 模式识别受体 QTL Quantitative Trait Locus 数量性状位点 RFLP restriction fragment length polymorphism 限制性片段长度多态性 RGA resistance gene analog 抗病基因同源序列 ROS reactive oxygen species 活性氧化物质 RT-PCR reverse transcriptase PCR 反转录 PCR rpm Revolutions per minute 每分钟转速
