《母胎间免疫调节与妊高征关系的初步研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《母胎间免疫调节与妊高征关系的初步研究（46页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、广州医学院硕士学位论文母胎间免疫调节与妊高征关系的初步研究姓名：袁晓兰申请学位级别：硕士专业：妇产科学指导教师：黄艳仪陈敦金20040522硕士学位论文母胎间免疫调节与妊高征关系的初步研究中文摘要母胎间免疫调节与妊高征关系的初步研究硕士研究生：袁晓兰导师：黄艳仪教授陈敦金剐教授广州医学院附属市二人民医院妇产科广州510150摘要妊娠高血压综合征(pregnancyinducedhypertension，PIH)简称妊高征，是以妊娠20周以后出现血压持续性升高及分娩后血压逐渐恢复正常为主要特征的疾病。妊高征是常见的妊娠期疾病，是围生期孕产妇的主要死亡原因之一。母胎界面是近年来研究妊娠免疫的一个热
2、点。妊娠被认为是一种特殊类型的同种异体移植，胎儿继承的父系移植抗原会刺激母体产生免疫反应，但母体常表现为免疫耐受状态，这是因为母胎间存在着一种复杂的免疫调节机制。研究己发现若母胎之间免疫平衡遭到破坏，发生免疫损伤，是导致流产、妊高征等病理妊娠的重要原因。妊高征被认为是母胎间免疫调节失衡的结果。有研究认为母胎、夫妻间HLA相容性增加可导致封闭抗体产生减少，此与妊高征密切相关，但是此类研究结果存在着争议。本课题通过测定在妊高征的发病中颇有争议的HLADR4基因。用流式细胞仪检测封闭抗体对配偶T淋巴细胞CD抗原的封闭效率，测定母体中起免疫刺激作用的抗滋养细胞膜抗体(TAIgG)，以探讨HLA-DR4
3、共享、封闭抗体及TAIgG在妊高征发病中的作用及三者之间的关系，对母胎间免疫平衡的机制作初步研究，为妊高征的免疫学防治提供一定的理论参考。材料和方法l、研究对象2002年12月至2004年1月产科住院的妊高征孕妇、配偶及胎儿共38家庭。包括轻度lO个家庭，中重度28个家庭。同期分娩的38个正常产妇家庭作为正硕士学位论文母胎问免疫调节与妊高征关系的初步研究中文摘要常妊娠组。2、实验分三部分(1)第一部分HLADR4共享与妊高征发病关系的研究用酚一氯仿方法提取DNA，PCRSSP方法进行PCR扩增。严格按试剂盒说明进行操作，在99bp及264bp片段上均出现扩增产物为HLADR4基因阳性，否则判为
4、阴性结果。(2)第二部分妊高征患者封闭抗体对配偶T淋巴细胞cD抗原的影响检测两组标本各20例。孕妇血清与男方外周血T淋巴细胞作用后，加入三色荧光标记的CD3、CD4、CD8单克隆抗体，以流式细胞仪分别计算血清中封闭抗体对CD抗原的封闭效率。(3)第三部分滋养细胞膜抗体(TAIgG)与妊高征相关性研究两组孕妇血清各38例，严格按照操作方法用酶联免疫吸附测定法(ELIsA)检测TAIgG。3、统计分析原始数据用SPSSIO0统计软件处理，计数资料采用，检验，计量资料采用f检验，检验水准=O05。结果l、两组人群HLADR4基因的检出率比较：妊高征组孕妇HLADR4阳性率(3684)高于正常妊娠组(
5、1579)，差异有显著性(PO05)。2、夫妻、母胎间HLADR4共享分析：妊高征组夫妻及母胎间HLA-DR4共享率与正常妊娠组相比增加，但差异无显著性(PO05)。但重度妊高征母胎间及夫妻间HLADR4共享率与正常妊娠组相比，呈显著增加，差异有显著性(P005)。但重度妊高征组与正常妊娠组相比，HLADR4共享率均呈显著增加。重度妊高征组夫妻问、母胎间HLA-DR4共享率分别为2143和2917，明显高于币常妊娠组，差异均有显著性(P(005)。见表2、3，图2。表2PIH组与正常妊娠组夫妻HLADR4共享比较表3PIH组与正常妊娠组母胎间HLADR4共享比较图2PIH组与正常妊娠组夫妻、母
6、胎问HLADR4共享比较硕士学位论文母胎间免疫调节与妊高征关系的初步研究第一部分三、HLADR4抗原基因阳性与阴性的妊高征组孕妇病情严重程度分析：总结HLADR4抗原基因阳性与阴性妊高征病人临床表现，我们发现HLADR4阳性病人多表现为重度妊高征，多有严重的蛋白尿、腹水、头痛等异常。表4lILADR4抗原基因阳性与阴性妊高征孕妇病情严重程度分析1：Marker2：阴性对照3：空白对照56：阳性对照478910：阴性标本1112：阳性标本图3PCR扩增产物电泳结果19硕士学位论文母胎问免疫调节与妊高征关系的初步研究第二部分第二部分妊高征患者封闭抗体对配偶T淋巴细胞CD抗原的影响此部分研究通过流式
7、细胞仪检测妊高征患者封闭抗体对配偶T淋巴细胞CD3、CD4、CD8抗原的封闭效率，分析妊高征患者封闭抗体的表达情况，同时与第一部分实验相比较，以了解HLADR4相容性与封闭抗体的关系，为妊高征的免疫治疗提供理论依据。材料与方法一、研究对象：妊高征组及正常妊娠组同第一部分。两组孕妇血清各20例，正常妊娠组孕妇与相应的妊高征组孕妇血清标本取自同一孕周，孕周从3136周，平均孕周为334周。二、主要试剂仪器1、主要试剂CD4FITCCD8R-PECD3CyQ三色荧光标记的单克隆抗体(IQ公司)CD4FITCCDsRPECD3Cy-Q同型阴性对照(IQ公司)淋巴细胞分离液：上海恒信化学试剂有限公司PB
8、S缓冲液(PH72)：市二医院血液室提供2、主要仪器光学显微镜(Olympus公司产品)离心机(上海医用分析仪器厂产品)流式细胞仪(美国BectonDiekenson公司)三、实验方法l、取孕妇外周静脉血2ml，2000rmin离心10min后，吸取血清。2、取其丈夫外周静脉血2ml(EDTA抗凝)，用23倍的Hanks液稀释抗凝血，缓缓加在淋巴细胞分离液面上，1500rmin，20min水平离心后，吸取分层液与血浆之间的乳白层至另一支试管。3、PBS液洗涤三次，1500rmin离心15min，弃去上清。显微镜下调节细胞20硕士学位论文母胎阔免疫调节与妊高征关系的初步研究第二部分浓度至1510
9、9L。4、取O1ml淋巴细胞4份，分别加入4支流式试管中后，向其中2支管中加入O1ml患者血清，另2支管中加入正常男性AB型血清，30孵育30分钟。5、向加患者血清、正常男性AB型血清的试管中分别加入20ul三色荧光标记的CD3、CD4、CDs单克隆抗体或IgG阴性对照，充分混匀，在室温下避光孵育20分钟，加入lmlPBS摇匀，1000rmin离心2min后，弃去上层液，加入200lPBS混匀。以流式细胞仪的配套软件CellQuest分析，分别计算出加女性血清及加AB型血清的男性配偶T淋巴细胞CD3、CD4、CD8比例。参考文献见【l81。6、根据下式计算封闭效率：封闭效率=加AB型血清CD比
10、例一加患者血清CD比例()四、统计分析原始数据用SPSSl00统计软件处理，采用t检验及LSDt检验，检验水准d=O05。实验结果一、封闭效率的流式细胞仪分析：图4左图表示AB型血清+淋巴细胞作用后，加入三色荧光标记的CD3、CD4、CD8单克隆抗体的流式细胞仪分析图像，右图表示待测血清+淋巴细胞作用后，加入三色荧光标记的CD3、CD4、CD8单克隆抗体的流式细胞仪分析图像。左图的左上象限显示的CD8百分比一右图的左上象限显示的CDB百分比即表示封闭抗体对配偶T淋巴细胞CDB抗原的封闭效率。对CD3、CD4抗原的封闭效率计算同上。圣盯12童1舯2r犍10oCDFIT(：唾瓤AB型血清+淋巴细胞
11、待测血清+淋巴细胞图4流式细胞仪分析图像2t硕士学位论文母胎间免疫调节与妊高征关系的初步研究第二部分二、两组封闭效率比较出表5可见正常妊娠组血清中封闭抗体对配偶外周血T淋巴细胞CD3、CD4、CD8抗原封闭效率(457092，385O60，226-+065)明显高于妊高征组(327O64，一2264-042，144O39)，两组相比差异有显著性(P005)。表5两组封闭抗体对配偶CD抗原封闭效率比较(XS)$与正常妊娠组相比P00l料：与正常妊娠组相比P001$与正常妊娠组相比P005三、夫妻间HLA-DR4共享与非共享妊高征孕妇封闭效率的分析妊高征夫妻HLADR4共享共有7对，其封闭抗体对C
12、D3、CD4、CD8的封闭效率明显低于HLADR4非共享组，差异均有显著性(PO05)。HLADR4共享及非共享妊高征夫妻封闭抗体对CD3、CD4、CD8的封闭效率与正常妊娠组相比下降，差异均有显著性(P005)。表6夫妻间HLADR4共享与非共享的妊高征封闭效率的比较(一XS)与正常妊娠组相比PO05$与正常妊娠组相比P005硕士学位论文母胎间免疫调节与妊高征关系的初步研究第三部分第三部分滋养细胞膜抗体与妊高征相关性研究滋养细胞表面表达滋养细胞膜抗原(TA)，母体可产生针对该抗原系统的免疫应答，正常孕妇血清中有抗TA的IgG，但抗体的水平很低。TA可诱导产生细胞毒淋巴细胞反应，破坏滋养层细胞
13、，对机体产生排斥作用。此部分用ELISA的方法研究TAIgG水平，以探讨妊高征时母胎界面免疫平衡情况。材料与方法一、研究对象妊高征组及正常妊娠组同第一部分，两组孕妇血清各38例。二、滋养细胞膜抗体(TAIgG)的检测试剂盒，购自深圳安群生物工程有限公司，采用酶联免疫吸附法(ELLSA)测定方法。三、实验方法l、取孕妇外周静脉血2ml，2000rmin离心10min后，吸取血清。2、配制洗涤液：每20ml加480ml蒸馏水。3、2ul血清与200ul标本稀释液混合，各加入100ix1阳性、阴性对照及待测标本于相应的纯化TA抗原包被的酶标板内，370孵育30rain。4、甩尽板中液体，用洗涤液反复
14、洗5次，每次均需拍干。5、每孔加入酶联物(酶标抗菌素IgG)100uL，置37孵育30min。6、甩尽板中液体，洗涤5次，拍干。7、加底物A及B各50ul，轻拍混匀，用酶标仪(450nm波长)以空白对照调零，测定各孔吸光度(A)值。四、统计分析原始数据用SPSSl00统计软件处理，采用t检验，检验水准n=O05。硕士学位论文母胎间免疫调节与妊高征关系的初步研究第三部分实验结果一、两组抗滋养细胞膜抗体(TAIgG)比较妊高征组妇女血清中抗滋养细胞膜抗体水平比F常妊娠组明显增高，差异有显著性(PO05)。表8妊高征夫妻间HLADR4共享与非共享TAIgG比较(xS)24硕士学位论文母胎间免疫调节与
15、妊高征关系的初步研究讨论讨论、ItLA-DR4抗原基因及夫妻、母胎共享在妊离征发病中的意义HLA是迄今所知最复杂的人类遗传多态性系统。1978年首先发现HLA与妊高征有关，我国学割憎】采用PCRSSO技术对上海地区17个妊高征家庭51例和14个正常家庭42例的HLADRBl基因多态性进行了研究，发现妊高征组HLADR4抗原频率、母胎HLADR4抗原共享和等位基因HLADRBl0405的基因频率较对照组显著增加。对日本人群的研究表明【20J，抗心磷脂抗体阳性的妊高征患者中HLADRBl04频率显著增大。从以上的研究我们可以看出HLADR4抗原基因和其它基因座位相比与妊高征的关系较为密切。此外HL
16、A的其它位点也有报道与妊高征有一定的关系。Honda21峰发现妊高征妇女HLADQBI04等位基因频率明显高于正常对照组。CarreiraszzJ等发现HLAG0104，DRBl0706，巨细胞病毒和胎儿表达来自母体的G0104可能是妊高征发生的一个原因，但此方面的相关报道并不多见。我们选择了较有争议的HLADR4抗原基因作为被检验基因，采用顺序特异性引物聚合酶链反应(PCR-ssP)方法，其方法同血清学分型方法相比有特异性强、重复性好的优点，对38个妊高征病人进行了的检测。我国汉族正常人HLADR4的携带者占17924左右【”l。我们实验结果发现3684妊高征病人HLADR4抗原基因阳性，与正常妊娠组相比有显著性差异，提示HLADR4与妊高征发病相关。推测HLADR4作为免疫应答基因影响母胎间免疫平衡，当这种平
