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1、分子细胞遗传学技术 与产前诊断 南京大学医学院 王亚平 2006年11月 基因诊断的中心问题是认识 遗传变异、基因突变 及与表型之间的关系 一、分子细胞遗传学技术 荧光原位杂交技术（fluorescence in site hybridization, FISH）：用荧光物质标记特异性DNA探针 ，与中期细胞染色体或间期细胞核杂交，鉴别和确定出生 缺陷、肿瘤细胞染色体异常，分辨率可达50500 kb. 荧光原位杂交技术（Fluorescence in site hybridization, FISH）的特异性DNA探针 基因座特异性探针：克隆扩增获得。在基因制图方面的 努力，越来越多的这方面探
2、针可以使用 着丝粒重复序列探针：这些特异性的探针可在中期染色 体和间期细胞核中产生强烈信号，可以鉴别特异性染色 体。 全染色体涂染探针：通过对来自特异性染色体分检库或 仅含一条人类染色体的杂种细胞DNA扩增制备。这种 DNA序列的混合物与一条染色体上的多个位点同源。因 此在中期核内，整条染色体得以被涂染。通过使用不同 的荧光素，在一个中期染色体涂片上可以鉴别几条不同 的染色体。 应用15号染色体一基因特异性 探针（红色）杂交确定其是否 缺失；绿色探针鉴定15号染色 体着丝粒。 24种不同染色体涂染探针杂 交得到的彩色染色体 染色体技术的 应用1 inv(14)(p12q24) t(2; 11)
3、(2q34; 11q13) 细胞遗传学研究中染色体技 术的应用FISH技术检出 t(2; 14) 染色体技术的 应用2 inv(9)(p12q13) 分子细胞遗传学：DMD基因第46号外显子缺失 细胞遗传学研究中染色体技术的应用 9号染色体涂染探针杂交。 箭头示易位到10号染色体上 的来自9号染色体的片段 21号染色体涂染探针FISH杂交 ，显示21三体 比较基因组杂交（comparative genomic hybridization, CGH） 近年在FISH技术基础上发展起来的一种新的分子细胞 遗传学技术（1992，Kallioniemi）。其基本原理是用 不同荧光物质分别标记肿瘤细胞D
4、NA和正常人细胞DNA ，然后与正常人中期细胞染色体杂交。 通过检测染色体上两种荧光信号的相对比值，了解肿 瘤细胞DNA拷贝数的变化，并可在染色体上定位。 这一技术已广泛应用于肿瘤基因组不平衡的检测。 比较基因组杂交的原理 待测DNA（肿瘤 细胞DNA，test DNA)为绿色 参照DNA(正常 细胞DNA， reference DNA） 为红色 复染为蓝色 人食管鳞癌细胞株的比较基因组杂交 A. 中期染色体的DAPI的 复染图 B. 中期染色体比较基因组杂 交（CGH）：红色区域表示 丢失，绿色区域表示扩增 。 CGH的优点： 经一次染色体原位杂交实验即可在整条染色体或染色 体区带水平对待检
5、基因组DNA序列拷贝数改变进行检测 和定位。 无需进行染色体培养，对于不易制备良好分裂相的实 体瘤尤为适用。 所需染色体DNA可来自各种组织，如新鲜组织、福尔马 林固定的组织、石蜡包埋组织，可在很少量的基础上 检测，利于做回顾性研究。 CGH的局限性： 难以检出以下异常：平衡易位，微小突变， 基因重排，倍体水平改变。 结果可能受到一些因素影响：正常细胞存在 ，肿瘤自身的遗传异质性，系统的波动。 灵敏度：限于检测较大范围的缺失（10 30MB） 二、突变分析与分子诊断 （一）基因突变类型 点突变：只有一个或几个核苷酸的改变，是突 变中最多见的形式。 稳定突变：传递中不改变原有的突变。 动态突变：
6、传递中不断改变自己，多见于短重 复序列的突变，在一代代传递中重复次数发生 明显变化。 点突变的结果： （1）同义突变（samesense mutation）：碱基替换后， 虽然密码子发生改变，但编码氨基酸没有改变（遗传密 码的兼并性），亦称静止突变。 （2）错义突变（missense mutation）：碱基替换，密码 子发生改变后，编码氨基酸亦发生改变，编码另一个氨 基酸。 （3）无义突变（nonsense mutation）：碱基替换后，使 编码氨基酸的密码子变成一个终止密码子。 （4）中性突变：包含两种情况，即“同义突变”和不改 变蛋白质功能的“错义突变” 基因突变形式碱基的插入和缺失
7、碱基的插入和缺失：基因编码序列中插入或丢失一个或 几个碱基，其结果是突变点下游碱基序列发生移码，编 码氨基酸序列都发生改变，又称移码突变（frameshift mutation），并可在突变点下游提前出现终止密码。 碱基的插入和缺失的结果：将导致移码突变（ frameshift mutation），并可在突变点下游提前出现终止 密码产生截短型蛋白 缺失突变 基因突变形式 框内突变（inframe mutation）：3个或是的 倍数的碱基缺失或插入导致的突变，使基因 丢失或增加1个或几个氨基酸。 DNA 大片段缺失或复制（large deletion or duplication)：几百个bp
8、至几十个kb的碱基 缺失或复制。 各种类型病理性突变的比例 w 无义突变和移码突变： 60 w 稀有的错义突变： 20 w DNA大片段缺失或重复: 20 另外：可能和疾病风险评估有关的大量的多态位 点 微小突变 （二）目前常用的对已知点突变的分析技术 限制性片段长度多态性（RFLP） 等位基因特异性（PCR）扩增（ASA） 等位基因特异性寡核苷酸杂交（ ASO） DNA芯片 1.限制性片段长度多态性（RFLP）分析 当突变影响到某一限制性内切酶位点时 ，可通过酶切PCR产物，电泳分析:限制 性片段长度多态性（RFLP） 2.等位基因特异性（PCR）扩增（ASA） 通过设计两个5端引物，一个与
9、正常DNA互补 ，一个与突变DNA互补。分别加入这两种引物 及3端引物进行两个平行的PCR，分析结果。 3.等位基因特异性寡核苷酸杂交（ ASO ） 设计两段寡核苷酸探针，其中包含发生突变 的位点，一段与野生型链互补，一段与突变 型链互补。 杂交分析是否存在突变 4.基因芯片：SNP位点的检测 Microarray-based method for genotyping of functional single nucleotide polymorphisms using dual-color fluorescence hybridization. Mutat Res. 2004; 548:
10、97-105 （三）目前常用的未知基因突变分析技术 异源双链体形成分析（ Heteroduplex analysis, HA） 单链构象多态性分析（Single-strand conformation analysis, SSCP） 变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE） 变性高效液相色谱分析（Denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC ） 体外蛋白截短实验（Protein truncation test, PTT） 定量多重PCR技术（Quantita
11、tive multiplex PCR, QM- PCR） 多重探针连接依赖性扩增技术（Multiplex Ligation- dependent Probe Amplifcation, MLPA) DNA序列分析（DNA sequencing) 1.异源双链体形成分析（HA） 由突变型和野生型DNA链形成的异源双链DNA在 其错配处形成一个凸起，电泳时会产生与相应 的同源双链DNA不同的迁移率，从而使两者得 以分离。 技术路线：PCR产物95C变性5分钟，37C复性 10分钟。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（0.2%硝酸 银染色） 2.变性梯度凝胶电泳（DGGE） 利用不同DNA序列开始变性时对变性
12、剂浓度的要求 不同，在变性剂浓度梯度凝胶内电泳，野生型DNA 和突变型DNA序列的差异所导致其变性点不同使两 者的电泳迁移率出现差异 3.单链构象多态性分析（SSCP） 单链DNA在中性条件下会形成二级结构。这种二级结构 依赖于其碱基的序列。即使只有一个碱基的不同，也 会形成不同的二级结构并可引起非变性条件下的电泳 迁移率的差异。 技术路线：PCR产物95C变性5分钟，立即置冰上。10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳。条件：电泳缓冲液0.5TBE，电 压70v, 4C环境下电泳过夜（0.2%硝酸银染色）。 4.体外蛋白截短试验（PTT） 从蛋白质水平检测基因的突变。其原理是碱 基缺失和插入导致的移码突变
13、、碱基替换出 现的无义突变均可使基因提前出现终止密码 ，从而截短mRNA翻译的蛋白质。 技术路线：血细胞RNAcDNART-PCR体外 蛋白质合成电泳分析截短了的蛋白质相 应基因片段的序列分析 上游引物5端均连接T7启动子序列 GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCATGG 35S甲硫氨酸，T7 体外转录/翻译体系（兔网 织红细胞提取物），30孵育90 min，完成体 外蛋白质合成。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 5.变性高效液相色谱分析（DHPLC） 1995年Oefner and Underhill 首次报道DHPLC技术。其 原理是在接近DNA融解温度条件下进
14、行离子对反相高效液 相色谱分析。 DHPLC分析突变的原理：在DNA部分变性的条件下，变异 型和野生型DNA可形成同源双链和异源双链根据其在层 析柱上保留的时间可以分辨出变异性型DNA. 用离子对反相高效液相色谱检测DNA变异是基 于同时存在同源双链和异源双链。异源双链的 检出取决于高效液相色谱的温度。而色谱温度 的选定与野生型DNA融解温度（Tm）有关。 DHPLC与其它突变分析技术的比较: 对单个核 苷酸变异的检出率: SSCP技术, 约75%； DHPLC, 90%. DHPLC的优点： 灵敏，准确； 分析速度快，单个样本的分析时间仅需几分 钟； 容易实现自动化操作； 适用于较大样本中基
15、因突变的筛选。 DHPLC分析：（野生型） DHPLC分析: 突变型（单个碱基改变） DHPLC分析: 突变型（单个碱基改变） 6.定量多重PCR技术（Quantitative multiplex PCR，Q-M-PCR） 目前各实验室普遍采用的突变基因分析技术对 基因微小突变的检测具有较高的敏感性，如对 单个碱基改变的检出率可达90%以上。但对于较 大的DNA缺失或DNA重复产生的突变，如以外显 子为单位的DNA缺失，SSCP、DHPLC等均难以将 其检出。有资料表明大片段DNA缺失可占基因突 变的三分之一 定量多重PCR技术要点： 涉及至少2个基因的多个外显子在一个反应管 内同时进行PCR
16、扩增，其中一个外显子作为参 照外显子，其余作为检测外显子； 控制PCR循环数，使PCR产物的增加处于对数增 长曲线内； PCR产物于DNA测序仪电泳，其结果经GeneScan 软件处理； 以检测外显子PCR产物与参照外显子PCR产物 的比值计算模版DNA相对拷贝数，确定是否存 在检测外显子的杂合性缺失； 检出的缺失经其它方法（长片段PCR或缺失断 裂点测序）确认。 7. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplifcation MLPA Denatured genomic DNA is hybridized with a mixture of more than 40 probes. Each MLPA probe consists of two
