《棉花黄萎病菌核糖体基因its区段特异扩增》由会员分享，可在线阅读，更多相关《棉花黄萎病菌核糖体基因its区段特异扩增（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、棉花黄葵病菌核枪体基因I T S区段特异扩增 朱有勇 王云月B r u c e R . l y o n t r云南农业大学云宙有植物脚理i点实脸室，里明6 5 0 2 0 1 , . 翻大和亚盆尼大学生命科学学院分子遗传学实孩室，悉尼2 0 0 6 ) 提县根据榨花黄英病的 ( V e r t i c i l l i u m d a h l i m) 核枪体券因I T S区 段的城基接踢序列， 诬计合成了 一 对为2 6 b p 的P C R种异扩增引 物。( 引物1 , 5 C A T C A G T C T C T C T G T T T A T A C C A A C G ，和引 物2
2、, 3 C G A T 0 0 0 A G C T G T A A C T A C T A C G C A A ) 进行7 大丽抢枝.P C R特异扩琦讥脸. 试脸枯果表明: 本实 脸诬计合成的 这时引 物， 能对大朋轮枝幼 全巷时 纽D N A和 人工甚种拍花黄英病病 株组奴 特井地护 增杯大航抢往位核特体基因I T S区 段3 2 4 b p 分予片 段， 该对引 物可用 于娜花黄英病的分于鉴定和分于 监侧。本实脸结果对招花黄葵病的早期诊断、政病机理研宪和拍侧拍很有漪十令t妥的砚实愈义. 关.词大丽抢技苗 特异扩增分子片 段 大丽轮枝菌引起数十种作物病害， 为重要的土传病原。 在世界各国棉
3、花产区， 引起楠花黄葵 病， 造成曹铃脱落和叶片 枯死， 严重地影响棉花的产f和质f。生产上迫切要求对棉花黄姜病菌 作深入研究， 探明 病原菌的消长动态分布和进行病害 早期诊断， 揭示病原菌的分子特性和发病的 内 在机理， 做好预测预报工作， 为棉花黄费病的防治提供科学依 据。 随着分子生物学技术的发展， 克隆和测序真菌核塘体荃因， 根据其分子特点进行真菌分类鉴 定和系 统发育研究， 为国际上广 泛使用的现代技术。 P C R扩增病原菌核精体墓因 某一特异分子片 段， 用于病原菌鉴定、 监测、 及病害诊断，由 于其快速、准确和简便的特点， 越来越受到各国病 理学家的高度重视。 本实验在研究组成
4、员B r u c e R y o n 博士等人完成了大丽轮枝菌核精体墓因I T S区段克隆和 浏序 ( 未发表)的基础上， 根据这一区域孩基编码序列， 设计和合成了一对特异扩增引 物， 并进 行大丽轮枝菌、多主棒菌、 炭疽菌、 镰刀菌以 及棉花病株组织的特异扩增。 本试验方法和结果对 深入研究大丽轮枝菌的分子鉴定与监测，以 及棉花黄葵病的早期诊断， 提供了科学依据和技术手 段，有着重要的现实意义。 现将研究工作报道如下。 1 材料与方法 1 . 1 供试材料 供试大丽轮枝菌( V e r t i c i l l i u m d a h l i a e ) 菌株为 笔者从澳大利亚不同棉花种植区
5、病株分离的1 0 个菌株， 编号分别为V -1 , V-1 7 , V -2 5 , V- 4 5 , V -5 8 , V-6 8 , V -7 8 , V -9 4 , V-1 0 0 1 和V - 1 0 0 6 。 由 斯里兰卡 徽生物 研究 所P r i y a , M . L 提供多主 棒抱菌 ( C o r y n e s p o r a 。二) 两个 菌株， 编号为C 一1 和C -2 ; 两个炭疽菌菌株 ( C o l l e t o t r i c h u m o r b i c u l a r e ) ， 编号为C 。 一1 和C 。 一 2 ; 一个尖抱裸刀菌菌株 (
6、F u s a r i u n o a y s p o r u n f . s p ) ， 编号为F -1 。 由D a l i b a g , S . M博士提供 4 个棉花品种 ( S i c a l a V Z , S i o k r a l , _ C s 5 0 , C s 1 8 9 ) 1 . 2 引物设计与合成 根据B r u c e , R . L y o n 博士对大丽轮枝菌核特体基因I T S区 段克隆测序结果 ( 未发表) ， 按照 R y c h l i k 和R h o d a d s ( 1 9 8 9 )计算机引物设计方法， 本实验设计和筛选了两个引物， 分别为
7、p i : 5 C A T C A G T C T C T C T G T T T A T A C C A A C G和P 2 : 3 C G A T G C G A G C T G T AA C T A C T A C G - 4 4 6 C A A, P C R扩增产物总长度为3 2 4 b p( 见下图) 。 引 物的合成， 公司产品)合成。 本实验使用的 对照引 物为I T S 通用引物I T S 1 和 I T S 4 , T C C T C C G C T T A T T G A T A T G C, 使用全自 动D N A合成仪 ( 贝克曼 :T C C GT A GG T GA
8、AC C T G C GG 二 形 1 . 3 供试材科祖板D N A组取 本实 脸 棋板D N A提取按R o e d e r 和B i o d a ( 1 9 8 5 ) 的 方法 进行， 提取后D N A橄粒落解在T E 级冲 液中 ( i o m M T r i s - H C I , 。 . l m m o l / L E D T A , p H 8 . 0 ) 使用核 徽浓度洲 试仪 ( P h a m a c i 。 公 司产品) 侧定 棋板D N A浓度， 并稀释至5 n g / p l 浓度 待用。 L4 栩 苗培育及位种 种子消毒后 ( 2 0 0 u 漂白 液， 2 0
9、分钟) ， 移入装有植物组织培养基的 直径为6 c m, 高1 5 c m的塑 料培 养休内， 恒 沮光服培养2 周 后进行接种. 接种方 法: 将病菌 培养皿 用无菌 水洗 下分生 抱子， 制 成1 X 1 0 抱 子 / m l 的 抱 子 悬 浮 液 . 棉 苗 从 培 养 钵 中 移 出 ， 用 无 菌 水 洗 根 ， 用 羌 菌 水 洗 根 ， 放 于 抱 子悬 浮液中 静I t 2 分钟后， 移 入新培养 体。 接种 后依 次1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 1 4 天 后取样. 每 次取样于幼苗茎墓1 0 c m处， 每次取样。 . 5 g 左右， 按上述D
10、 N A提取法. 提取模板D N A待用。 盆 载 试 脸 为 人 工 接 种 后3 天 ， 、从 摘 0 4 中 替 稗 于 温 室 沙 稗 忠 ，每肠一，取样及提取 D N A方法同上。 1 . 5 P C R扩增条件 +r l r f _.P C R r i# 反 应 终 户 挽丛丝空一少钾帐嘿 醉 1 * A 1 9 ) , ” ” 早 位 .1 , A t 货 呀兀 灵 日 Y s O ri 4 畔攫乎 拼 鲜 的浓度均为2 m M;每一引物浓度为2 U M,棋板D N A刃2 5 u g o 手 材 笋 液 一 次 液 ( 由T a g D N A聚合 CTP、 d G T P和
11、d T T P I C - 1 0 。 热循环控俐仪 ( 美国M. 7 . R e s e a r c h 产品) 退火3 0 秒， 7 4 C 延伸1 分钟 1 . 6 结里检洲 中 进 行扩 增。 扩 增循环为9 4 C 预 变性2 分钟， 9 4 变性1 分钟， 5 1 C ， 4 。 个循环， 最后7 4 1C 延伸1 0 分钟。 P C R扩增反应完毕后， 每样品取5 p 1 反应液在含有0 . 3 n g / t n 1 澳化乙 锭的1 . 4 % 琼脂精胶上进 行电 泳， ( 电泳缓冲夜为T B E 级冲 液， 0 . 0 8 9 M T r i s - b o r a t ,
12、0 . 0 8 9 Mb o r i c a c i d 和0 . O O Z ME D T A ) , 电泳结束后， 置于紫外照射仪上观察结果并照相。 2 结果与分析 2 . 1 特异片段扩增结果 按上述方法， 使用标准大丽轮枝菌D N A为模板D N A进行扩增， 结果见图1 。 从图1 中看出， 使 用 本 实 脸 设计合 成的 这 对引 物 从大 丽 轮 枝 菌 全 荃因 组刀 N A扩 增 到了3 2 4 b p 特 异D N A分 子片 段， 达到了预期设计结果。 4 4 7 .1用 * 鑫 . 设 计 合 成 的 引 对 大 . 枪 往 . 公 板D N A 犷 . 拍 . 1
13、, 3 泳道为分子f标记 ( ) ,D N A / H p . 曲切) 1 2 泳道为大，轮枝蔺P C R扩增产钧 2 . 2 对不一 自.Xlr 和不同栩 花品 种的特 异扩猫 结报 使用 本实 脸设计合成的 引 物， 进行了1 0 个太丽粉枝 ， 株、 5 个其它真， 株和3 个主 要楠 花品 种的模板D N A特异扩增， 结果如图2 所示。 从田2 粉出， 1 0 个来自 不同楠区的大日轮杖润， 曹株， 都同时扩增到了3 2 4 b p 长度的特异分子片段， 尖 推雄刀，一 个， 株 均扭有扩 增到 这条特异片段 而多主棒，2 个，株、 炭疽翻盆2 个菌株及 . 、户 。同祥， 3 个伯
14、花品种 ( S i c a l a V C s 5 0 , C a 1 8 9 ) 也没有这一特 异片 段的P C R产 物. 结果摘 范肴出， 只对大困轮枝，棋板D N A能扩增3 2 4 b p 的特异分于片段， 记。 本 实 雄 设 计 的引 物 具有 特 异 扩 it 作 用， 且这一分子片段可作为该曲的探洲标 . 2 不.，.宾.和不目.花品一的扩场.果 1 泳道为分子f标记 。 D N A / H p 1 0切) . 2 - 1 1 泳道为大蔺轮枝菌1 0 个.株. 偏 号依次为V -1 , V -1 7 , V -2 5 , V - 4 5 , V -5 8 , V -6 8 ,
15、 V -7 8 , V -9 4 , V -1 0 0 1 和V -1 0 0 6 , 1 2 - 1 3 位道为主棒戒病.的两个，株， 1 4 - 1 5 像道为炭疽翻，两个菌 株. 1 6 泳道为尖抽.刀口，株; 1 7 - 1 9 泳遨为3 个楠花品种， 依次为S i c a L V C a 5 0 和C 8 1 8 9 1 2 0 泳道为无模板D N A扩增对盈 2 . 3 设计引 . ( P 1 , P 2 ) 和 通用引 . ( I T S 1 , I T S 4 ) 对抽 花自株和 t株姐积的 扩增结 县 在同样的扩增条件下， 分别从棉花品种( S i O l c r a l =
16、 , ) 健株和人工接种病橄取样， 提取棋板D N A, 用本实脸设计物 ( P 1 , P 2 ) 和通用引 物 ( M I , I T 8 4 ) 扩增， P C R扩增结果如图3 所示。 从图3 看出， I T S i 和I T S 4 引物对病株扩增出两条分子片段，( 其中一条为楠花】 T S 区 段， 分子f约为 7 5 0 b p , 另 一 条 为 轮 枝 菌 全 I T S 区 段 .， ， 分 子 f 约 为 5 6 0 b p ) ， 对 健 株 只 扩 增 出 楠 花 IT S 区 段 的 分 子 片段; 本实 脸设计引 物( P i 和1 3 2 ) 对病株特异扩 增出I T S 区 域中3 2 4 b p 分子片 段， 对健 株无 扩增 4 4 8 产物。 . 3 . 异 引 喊 州 1 , 7 泳道为 对 病 株 和 健 侧卿拍 幼 果， 6 泳 遨 为 羌 徽 盘加A 护 幼 对屁 i_咖娜 .:娜咖吵钾 的 扩 二 r 秒妙; 华挤 娜I S 3 ,1月( T T S 卜
