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1、水产品中4-己基间苯二酚的测定 高效液相色谱法编 制 说 明一、任务来源，起草单位、协作单位、主要起草人水产品中4-己基间苯二酚的测定 高效液相色谱法标准由山东省卫生厅立项，依据山东省卫生厅关于委托承担山东省食品安全地方标准研制工作的函（鲁卫食安函20123号）文件要求，由山东省海洋水产研究所承担该标准的制定任务。本标准主要起草人：宫向红、徐英江、邹荣婕、李佳蔚、刘慧慧、田秀慧、于召强、邓旭修。二、制定标准的必要性和意义4-己基间苯二酚（4-HR），别名：1-(2,4-二羟基苯基)己烷；1,3-二羟基-4-己基苯；4-己基-1,3-二羟基苯；己基树脂酚；己雷琐辛；4-己基-1,3-苯二酚。分子
2、量：194.28。结构式：4-HR作为抗氧化剂，主要用于虾、蟹类水产品的加工中，其目的是防止产品在贮存过程中由于多酚氧化酶的催化而发生的氧化褐变或色泽变黑的现象出现。其后又应用在其它蔬菜水果的保鲜上，可抑制蘑菇、鲜切梨、马铃薯的褐变，延长鲜切苹果的贮藏期，并能抑制微生物的生长，起到抗菌作用。目前，4-HR 在食品上的应用已引起国内的关注。联合国FAO/WHO 所属JECFA 于1995 年第44 次会议上，第一次准许使用4-HR，在其ADI 值的说明中：“对甲壳类的处理浓度最高为50 mg/L，食用部位的最高残留量约1mg/kg，可无毒性问题，ADI 不做限制性规定”。根据我国食品添加剂使用卫
3、生标准（GB27602011）中规定：可按生产需要用于防止虾类褐变，其使用后残留量应1mg/kg。使用时可配成一定浓度的浸泡液，将需要处理的虾类置于溶液浸泡。联合国FAO/WHO 所属JECFA规定对甲壳类的处理浓度最高为50 mg/L，食用部位的最高残留量约1 mg/kg。2012年卫生部将4-HR列入拟取消的38种食品添加剂之一。根据现有的资料查询，国内尚无水产品中4-HR 检测方法标准，可见在该种添加剂的监管上，目前面临的首要问题是标准的缺位。残留监测是确保食品安全和人类健康的最后一道防线，测定标准是残留监测的依据，因此必须建立灵敏度高、准确性好的检测方法，从源头上规范4-己基间苯二酚的
4、使用，以确保我国水产品安全、维护公众身体健康。三、主要起草过程山东省海洋水产研究所在接到山东省卫生厅下达的水产品中4-己基间苯二酚的测定 高效液相色谱法标准制定任务后，成立了标准制定小组，在仪器设备、试验材料和资料检索等方面做了充分准备，并对所检索到的资料进行了综合分析，确定了实验方案；本标准在制定过程中主要参考了国内外先进的检测技术，通过试验条件的筛选，确定了最佳方法，并对方法的适用性、回收率、精密度及检出限进行了试验。2012年1月2012年6月，对不同的水产品进行了提取、加标试验，通过对提取剂的筛选、净化方法的优化等研究实验，完成了水产品中4-己基间苯二酚检测方法的适用性、回收率、精密度
5、及检出限等试验工作。2012年7月2012年8月，依据GB/T 1.1-2009 标准化工作导则 第一部分：标准的结构和编写规则、GB 2001.4-2001 标准编写规则 第四部分：化学分析方法对标准进行了编写，完成了本标准的送审稿。四、制定标准的原则和依据，与现行法律、法规、标准的关系（一）标准编制原则 本标准制定的主要原则，一是保证水产品的卫生安全，遵循“保证基本安全和大众消费”宗旨；二是标准具有科学性和可操作性，有利于实际生产的指导和产品认证工作；三是与先进国家的标准相接轨，适应加入WTO后国际市场对水产品安全性的要求，标准具有先进性。（二）与现行法律、法规、标准的关系联合国FAO/W
6、HO 所属JECFA规定4-HR对甲壳类的处理浓度最高为50 mg/L，食用部位的最高残留量约1 mg/kg；我国食品添加剂使用卫生标准（GB 27602011）中规定：4-HR可按生产需要用于防止虾类褐变，其使用后残留量应1mg/kg。本标准的灵敏度均能满足以上要求。标准的制定符合我国的食品卫生法、产品质量法、水产品卫生管理办法、标准化法等法律、法规精神，与有关的现行法律、法规和强制性标准相协调，没有矛盾。五、主要条款的说明，主要技术指标、参数、试验验证的论述1标准适用范围的说明本标准规定了水产品中4-己基间苯二酚（4-HR）残留量的液相色谱测定方法，适用范围是水产品可食组织中4-HR残留量
7、的检测。2方法原理样品用乙腈提取，乙腈饱和正己烷去脂，用高效液相色谱仪进行测定，外标法定量。3方法主要参数及实验条件的确定3.1 提取方法的选择根据4-HR的物理性质，微溶于水易溶于极性有机溶剂，选择乙腈、甲醇、乙酸乙酯三种溶剂为提取剂。3种溶剂均能提取4-HR，但是甲醇和乙酸乙酯提取后均需要蒸干，用流动相复溶后，再用正己烷去除脂肪，方可上机测定，操作步骤较繁琐。而用乙腈提取时可直接用乙腈饱和正己烷去除脂肪，上机测定未见有干扰峰，方法方便快捷，故本标准采用乙腈进行提取。在优化提取条件时，采用向虾中添加浓度为1.0 mg/kg 的4-HR，分别用乙腈分一次（25 mL）、两次（15、8 mL）和
8、三次（10、8、5 mL）提取，回收率依次为79%、91% 和93%，因此选择用25 mL乙腈分两次提取（15、8 mL）。3. 2 净化条件的选择试验证明，采用乙腈饱和正己烷去除样品溶液中的脂肪等杂质，4-HR没有损失，且净化效果满意，所以采用乙腈饱和正己烷对样品进行净化。3.3液相色谱分析条件的确定3.3.1 推荐的色谱柱C18（150 mm4.6 mm，5m）或性能相当者。3.3.2 检测波长的确定4-HR具有荧光性质，选择DAD 和FLD 两种检测器对其进行比较实验，结果显示，FLD 的灵敏度明显高于DAD 的灵敏度，且抗干扰能力比较强。分别固定激发波长和发射波长进行扫描，确定4-HR
9、 的最大激发波长为280nm，最大发射波长为320nm。3.3.3流动相的选择采用甲醇-水体系为流动相，试验比较了不同比例流动相等度洗脱对测定结果的影响。结果表明，4-HR虽能与杂峰分离，但峰形不够对称，而采用甲醇-乙腈-水体系可有效地改善峰形，提高了灵敏度，经试验确定甲醇-乙腈-水（体积比为501535）等度洗脱，不仅能将待测物很好地分离出来，不受杂峰的干扰，且出峰时间较适中，峰宽、峰形等定量条件较好。标准谱图、空白样品谱图、加标样品谱图见图110。图1 标准溶液色谱图（100 g/L）图2 空白对虾样品色谱图图3对虾加标样品色谱图（添加量0.1 mg/kg）图4对虾加标样品色谱图（添加量1
10、.0 mg/kg）图5 空白梭子蟹样品色谱图图6 梭子蟹加标样品色谱图（添加量0.1 mg/kg）图7 梭子蟹加标样品色谱图（添加量1.0 mg/kg）图8 空白鲤鱼样品色谱图图9 鲤鱼加标样品色谱图（添加量0.1 mg/kg）图10 鲤鱼加标样品色谱图（添加量1.0 mg/kg）3.4 方法回收率和精密度分别选用阴性的对虾、梭子蟹、鲤鱼进行加标回收和精密度实验，考察方法的准确度和重现性。实验采用在5.0 g样品中分别添加0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg和2.0 mg/kg水平的标准溶液，每个水平加标6个样品，测定3个批次。实验结果：平均回收率都在70%以上，批内、批
11、间相对标准偏差均在10%以下（见表1）。表1 回收率及精密度样品添加量（mg/kg）测定批次平均回收率（%，n=6）批内相对标准偏差（%）批间相对标准偏差（%，n=18）对虾0.1170.27.67.4274.47.0376.16.80.5180.64.65.1277.55.4378.84.81.0181.34.44.6284.25.1382.74.22.0184.84.24.5289.64.6386.75.1梭子蟹0.1172.26.96.8272.87.1377.66.60.5178.24.55.4274.85.6381.95.21.0184.35.44.9283.14.8387.64.4
12、2.0193.74.24.1291.84.2389.64.6鲤鱼0.1177.66.77.0278.26.5374.86.80.5179.55.55.7278.85.2381.15.61.0184.25.14.9282.54.7383.84.82.0186.75.25.0284.25.4383.64.83.6 方法的检出限及线性范围分别在对虾、梭子蟹、鲤鱼中添加4-HR 0.05 mg/kg时信噪比大于3，确定方法检出限为0.05 mg/kg，分别在对虾、梭子蟹中添加4-HR 0.1 mg/kg时信噪比大于10（见图3、图6、图9），回收率均大于70%，因此最终确定该方法的定量限为0.1 mg/kg。空白样品谱图见图2、图5、图8。取4-HR标准中间液，用乙腈稀释成浓度范围为0.01 g/mL0.5 g/mL的标准工作液。取20 L进样，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线（见图11）。方法线性范围、回归方程见表2，相关系数均大于0.998。表2 方法线性范围、回归方程、相关系数待测物线性范围回归方程相关系数4-HR0.01 g/mL0.5 g/mLY=3.37e+006X+8.40e+003r=0.9987图11 4-HR标准曲线六重大意见分歧的处理依据和结果 无重大分歧七其它需要说明的事项 无。
